α-淀粉酶产生菌的生长曲线绘制及酶活测定

α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chromatography)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。

20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。

到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromatography, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。

但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。

20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。

自20世纪40年代以来以Martin为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。

20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。

而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。

同样，石化工业的发展也使色谱技术特别是气相色谱得到广泛的应用。

气相色谱的仪器也不断得到改进和完善，气相色谱逐渐成为一种工业分析必不可少的手段和工具。

20世纪80年代以后我国也大规模采用气相色谱和高效液相色谱。

实验一产酶微生物的分离、纯化与选育酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。

由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒,环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。

目前,能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶,葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的.通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。

2。

蛋白酶产生菌的分离与纯化2。

1 实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化.2。

2 实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶,细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌.本实验将土壤样品（或其他样品)悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛.也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养,分离筛选其他蛋白酶产生菌。

2.3 实验仪器与材料土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液;显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。

2。

4 实验方法与步骤2。

4.1 分离1)采集土壤样品，用无菌水制备1:10土壤悬液；2）取1:10土壤悬液5ml,注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75—80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置,于30-32 ℃培养24-48 h；4)对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片,做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。

2。

4。

2 筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基,再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24—48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径.2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。

测定α淀粉酶活性降落数值是粮食检验中，评价小麦面粉等粮食品质的一项重要指标，反映了小麦籽粒中a一淀粉酶活性的大小：a一淀粉酶活性低，则降落数值高；反之，a一淀粉酶活性高，则降落数值低。

ST006降落值仪本产品适用于谷物、面粉及其它含有淀粉的产品中a —淀粉酶活性的测定，是粮食贮藏、面粉加工、食品加工等领域中质量检定的重要测量仪器。

本仪器是按照Hagbery—Perten法对谷物和面粉中a —淀粉酶活性指标进行测定，符合国家标准执行GB/T10361-2008《谷物降落数值测定法》。

仪器原理：小麦粉或其它谷物中含大量的淀粉、在沸水浴中，悬浮液能迅速糊化，同时淀粉中的a一淀粉酶使淀粉不同程度的被水解，淀粉糊的粘度将下降，因此，在一定条件下，小麦粉糊化物的粘度，反映了a一淀粉酶活性的大小。

当水温达到100℃时，将装有麦粉糊的试管放入浴缸内，用粘度计搅拌锤，以2次/秒的速度开始搅拌，60秒后，锤停止在最高位置。

锤靠自身重量经过被酶液化的麦酶湖悬浮液在热凝胶中降落一定距离所需的时间，用（S秒）表示降落数值。

实际意义：在粮食收购及面粉加工中，降落数值测定仪具有重要的意义。

在粮食收购中，有关部门可以根据入库小麦降落数值，进行分类分仓储存，避免发芽小麦与好的小麦互混，降低小麦品质，造成不必要的经济损失；在面粉加工中，小麦加工最佳区为降落数值在200s—300s，其他区域的小麦— 1 —要进行合理搭配。

小麦粉降落数值在150s以下，必须搭配95％左右没有发芽的小麦，加工后的面粉才能保证各项指标全部合格。

不同面食制品对面粉中α-淀粉酶活性要求不一样，如面包用粉的降落数值为250～350秒；糕点用粉为≥160秒；酥性饼干用粉为≥150秒；饺子、馒头用粉为≥250秒；面条用粉为≥200秒等。

小麦粉的加工根据降落数值的指导，更加的科学合理。

— 2 —。

安徽农业科学１６０ｒ／ｖａｉｎ摇床培养１２ｈ／’种子液以１０％的接种量接种于产酶发酵培养基上，３７℃、１６０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ后发酵液５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液测酶活力。

选取酶活力较高的菌株作为试验菌种。

１．４．Ｌ３酶活力的测定一１。

仅一淀粉酶能将淀粉水解为长短不一的短链糊精和少量的还原糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应逐渐消失，可以用这种显色消失的速度来衡量酶的活力。

用ＹｏｕｎｇＪ．Ｙ００改良法：取５ｒＩｌｌ０．５％可溶性淀粉溶液，在４０℃水浴中预热１０ｍｉｎ，然后加入适当稀释的酶液０．５ｍｌ，反应５ｍｉｎ后用５Ｉｌｌｌ０．１ｍｏｌ／ＬＨ２Ｓ０４溶液终止反应。

取０．５ｍ１反应液与５ｌＩｌｌ工作碘液显色，在６２０ｎｍ波长处测光密度。

以０．５ｍｌ水代替０．５ｒＩｌｌ反应液为空白，以不加酶液（加相同的水）的管为对照。

，酶活力单位定义为：在４０℃、５ｖａｉｎ内水解ｌｎ蟮淀粉（０．５％淀粉）的酶量为１个活力单位。

酶活力计算公式如下：酶活力（ｕ／ＩＩｌｌ）＝（民一Ｒ）／ＲｏＸ５０ＸＤ式中，尺。

、Ｒ分别为对照、反应液的光密度；Ｄ为酶的稀释倍数，调整Ｄ使（Ｒ一尺）／民在０．２～０．７。

１．４．２酶学性质的研究。

１．４．２．１酶反应最适温度的确定。

设置４０、６０、８０℃３个温度梯度，测定反应体系在不同温度下的酶活力，确定酶反应的最适温度。

１．４．２．２酶反应最适ｐＨ值的确定。

用不同的缓冲液设置ｐＨ值为４、６、ｌＯ３个梯度值，测定反应系在不同ｐＨ值下的酶活力，确定酶反应的最适ｐＨ值。

１．４．２．３ｃａ２＋对酶热稳定性的影响。

在１００℃下调整酶液中Ｃａ２＋的不同浓度，测定不同时间Ｆ的酶活力，确定ｃｄ＋对酶热稳定性的影响。

２结果与分析２．１Ｏｒ＂淀粉酶生产菌株的分离筛选２．１．１初筛结果。

采用碘熏法从淀粉筛选平板｝＝挑出ｌＯ株有明显淀粉水解圈（图１）的菌株。

图１菌种的水解圈Ｆｉｇ．１Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｃｉｒｃｌｅｏｆｓｔｒａｉｎ２．１．２复筛结果。