结核杆菌快速培养,耐药性的临床应用研究
- 格式：pdf
- 大小：91.60 KB
- 文档页数：3
２００８年３月第５卷第７期・临床研究・
中国医药导报ＣＨＩＮＡＭＥＤＩＣＡＬＨＥＲＡＬＤ结核杆菌快速培养、耐药性的临床应用研究
张涛，赵锦，佟立峰（深圳市南山区慢性病防治院，广东深圳５１８０５４）
［摘要］目的：采用快速变色液体培养基进行结核杆菌培养及药物敏感性试验，建立一种适合基层实验室使用的快
速培养及药敏试验方法。方法：①疑似肺结核痰标本２００例镜检后分别接种于变色培养基和Ｌ－Ｊ培养基培养并观
察结果。②３５株结核杆菌采用变色培养法与罗氏绝对浓度法，６５株结核杆菌采用变色培养法与罗氏比例法，分别
进行药物敏感性试验。结果：变色培养基培养阳性率、污染率与Ｌ－Ｊ培养基无显著性差异，培养阳性时间明显缩
短；变色培养法与绝对浓度法药敏结果相比，符合率为６０％，与比例法药敏结果相比，符合率为５６．９％，药敏试验培
养时间显著缩短。结论：采用快速变色培养基进行培养及药敏试验，提高了分枝杆菌快速检测水平，具有较好的基
层推广价值。［关键词］分枝杆菌；快速培养；药敏试验［中图分类号］Ｒ４４６［文献标识码］Ａ［文章编号］１６７３－７２１０（２００８）０３（ａ）－０４６－０３
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｑｕｉｃｋｃｏｌｏｕｒｉｎｇｌｉｑｕｉｄｍｅｄｉｕｍａｎｄｑｕｉｃｋａｌ－
ｌｏｃｈｒｏｉｃｄｒｕｇ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｅｓｔ
ＺＨＡＮＧＴａｏ，ＺＨＡＯＪｉｎ，ＴＯＮＧＬｉ－ｆｅｎｇ
（ＣｈｒｏｎｉｃＤｉｓｅａｓｅＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＮａｎｓｈａｎＤｉｓｔｒｉｃｔ，ＳｈｅｎＺｈｅｎ５１８０５２，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｕｓｉｎｇｑｕｉｃｋｃｏｌｏｕｒｉｎｇｌｉｑｕｉｄｍｅｄｉｕｍｔｏｄｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔ，ｔｏ
ｅｓｔａｂｌｉｓｈａｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｖｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｌｏｗ－ｃｏｓｔｍｅｔｈｏｄｏｆｒａｐｉｄｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｄｒｕｇ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｅｓｔｆｏｒｂａｓｉｃｌｅｖｅｌｌａｂ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ：①Ｓｐｕｔｕｍｓａｍｐｌｅｓｏｆ２００ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ－ｌｉｋｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｔｏｑｕｉｃｋｃｏｌｏｒｉｎｇｌｉｑｕｉｄｍｅｄｉｕｍａｎｄＬ－Ｊ
ｍｅｄｉｕｍｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙａｆｔｅｒｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎｂｙｔｈｉｃｋｓｍｅａｒｉｎｇＡｃｉｄ－Ｆａｓｔｓｔａｉｎ．②３５ｓｔｒａｉｎｓｏｆｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｗｅｒｅ
ａｐｐｌｉｅｄｂｙｍｅｔｈｏｄｏｆｑｕｉｃｋ，ｌｉｑｕｉｄｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆＬ－Ｊ，６５ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｐｐｌｉｅｄｂｙｍｅｔｈｏｄｏｆｑｕｉｃｋ，
ｌｉｑｕｉｄｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆＬ－ＪｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｉｒｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｏｆＳＭ，ＩＮＨ，ＲＦＰａｎｄＥＢ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｆｏｒｐｏｓｔｉｖｅ
ｒａｔｅａｎｄｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｒａｔｅ，ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｍａｒｋｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｑｕｉｃｋｃｏｌｏｕｒｉｎｇｌｉｑｕｉｄｍｅｄｉｕｍａｎｄＬ－Ｊｍｅｄｉｕｍ（Ｐ＞
０．０５），ｂｕｔｔｈｅｒｅｗａｓａｍａｒｋｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅｔｗｏｇｒｏｕｐｏｆｄａｔａｏｎａｖｅｒａｇｅｇｒｏｗｔｈｔｉｍｅ（Ｐ＜０．０５）；Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｕｓｃｅｐｔｉ－
ｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｂｙｍｅｔｈｏｄｏｆｑｕｉｃｋ，ｌｉｑｕｉｄｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆＬ－Ｊｓｈｏｗｔｈａｔｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅｉｓ６０％，Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ
ｏｆｑｕｉｃｋ，ｌｉｑｕｉｄｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｈｏｗｔｈａｔｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅｉｓ５６．９％．Ａｖｅｒａｇｅｇｒｏｗｔｈｔｉｍｅｏｆｄｒｕｇ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｅｓｔ
ｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｓｈｏｒｔｅｎｔｈａｎｒｏｕｔｉｎｅｔｅｓｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｉｔｃａｎｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｒａｐｉｄｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎｔｏｕｓｅｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ
ｑｕｉｃｋｃｏｌｏｕｒｉｎｇｌｉｑｕｉｄｍｅｄｉｕｍｔｏｄｏｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｄｒｕｇ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｅｓｔ，ａｎｄｈａｓｌｏｃａｌｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄ
ｇｅｎｅｒａｌｉｚｉｎｇｖａｌｕｅ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｌｉｑｕｉｄｒａｐｉｄｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ；Ｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｅｓｔ
现将结核杆菌快速培养、耐药性的临床应用研究介绍如下：１材料与方法１．１一般资料
快速变色液体培养试剂盒及快速变色液体药敏试剂盒
由深圳市怡百世生物技术有限公司提供。其主要成分为磷酸
盐缓冲液、谷氨酸钠、多种维生素、多种微量元素、甘油、马血
清、变色剂以及甲氧卡氨嘧啶、氨苄青霉素、多黏菌素Ｂ、两
性霉素Ｂ和萘啶酸等多种抗生素。
改良Ｌ－Ｊ培养基及抗结核药物培养基由深圳市慢病院
提供。１．２病例来源１．２．１快速变色液体培养２００例痰标本均来自２００１年９
月～２００４年４月我院肺结核专科接诊的疑似肺结核病人，其
中，男性１３２例，女性６８例。１．２．２快速变色液体培养药敏试验选自２００３年４月～２００５年１０月我院肺结核门诊肺结核病人痰标本培养分枝杆菌阳性病
人１００例（株）并经菌型鉴定：人型９８株，非典型分枝杆菌２株。１．３方法１．３．１快速变色液体培养包括：①痰标本收集：受检对象留
取清晨痰标本３～５ｍｌ，无痰者用１０％盐水作超声雾化、留即
时痰１份备检。②涂片：采用痰厚涂片萋尼氏染色法抗酸染
色镜检。③培养：痰标本采用４％ＮａＯＨ经２～４倍体积消化２０ｍｉｎ后，５０００～１００００转／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ，沉淀经无菌１／
１５／ＬｐＨ６．８磷酸盐缓冲液洗涤２次，再加入１ｍｌ上述缓冲液
混悬沉淀，各取０．５ｍｌ，分别接种于变色液体培养基和改良Ｌ－Ｊ培养基中３７℃培养。④结果观察与报告：变色液体培养
基接种后，每天观察１次，２周后隔天观察１次，若培养基变
为紫红色或底层有紫色颗粒沉淀时，作涂片抗酸染色，证实
有分枝杆菌时，报告分枝杆菌培养阳性。改良Ｌ－Ｊ培养基接
种后分别于第３天和第７天观察结果，以后每周观察１次。８４６
２００８年３月第５卷第７期・临床研究・
ＣＨＩＮＡＭＥＤＩＣＡＬＨＥＲＡＬＤ中国医药导报周未见生长，报告分枝杆菌培养阴性。１．３．２液体变色培养基药敏测定用接种环刮取改良罗氏培
养基上生长３～４周的菌落一环，置于磨菌瓶中，旋紧瓶盖后
旋涡混匀，用试剂Ａ调其浊度为１ｍｇ／ｍｌ的菌悬液，对照孔
加试剂Ａ１９８μｌ和菌液２μｌ，加入试剂Ｂ１μｌ、试剂Ｃ５０μｌ；
测定孔（含药ＳＭ、ＬＮＨ、ＲＦＰ、ＥＢ）每孔加入２００μｌ菌悬液、再
加入试剂Ｃ５０μｌ，３７℃培养，每天观察结果１次，对照孔变色
后，加入试剂Ｂ１μｌ于各测试孔底部，３７℃培养３ｈ观察结
果。结果判断：当对照孔变色后，测定孔变为紫红色为耐药，
不变色为敏感。１．３．３改良罗氏绝对浓度法参考《结核病诊断细菌学检测规
程》１９９５年版，由我院完成，含药种类为ＳＭ、ＩＮＨ、ＲＦＰ、ＥＢ。１．３．４改良罗氏比例法由深圳市慢病院细菌室完成，含药种
类为ＳＭ、ＬＮＨ、ＲＦＰ、ＥＢ。１．４统计学处理
两组样本阳性率的比较采用卡方检验，Ｐ＜０．０５为有显著
性差异。２结果２．１２００例痰标本３种方法检测结果及２种培养方法细菌生
长周期的比较７９例涂片阳性痰标本中，Ｌ－Ｊ培养阳性７７例，涂阳培养
率为９７．４％，变色液体培养基培养阳性７５例，污染２例，涂阳
培养率９４．９％。１２１例痰涂片阴性标本中，２种培养法均为阳
性１１例，单纯Ｌ－Ｊ培养阳性５例，涂阴培阳率为１３．２％（１６／１２１）。单纯变色液体培养基阳性１２例，涂阴培阳率为１９％
（２３／１２１）。Ｌ－Ｊ培养基细菌生长天数最短１３ｄ，最长４５ｄ，平
均为２６ｄ。变色液体培养基生长天数最短４ｄ，最长２５ｄ，平
均为１３ｄ。比较结果详见表１、表２。
表１３种试验方法分枝杆菌检出结果比较［ｎ（％）］
表２两种分枝杆菌培养方法细菌生长周期比较
２．２三种分枝杆菌药敏结果比较及快速液体培养法药敏试验
培养时间观察
２．２．１绝对浓度法，液体变色培养法药物敏感性结果比较３５
株采用液体变色培养基测定法与绝对浓度法的药敏试验见
表３。结果表明，两种方法均为敏感９例，耐药结果相同１２
株（其中，单耐２例，耐两药３例，多重耐药７例），２种方法
结果完全相符共２１例，符合率６０％（２１／３５），有１４株两种方
法检测结果不符。以绝对浓度法药敏结果为判断标准，则液
体快速培养法检测各种药物耐药性的阳性预期值（ＰＰＶ）、阴
性预期值（ＮＰＶ）和准确率分别见表４。
２．２．２比例法，液体变色培养法药物敏感性结果比较６５株采
用液体变色培养基测量法与比例法的药敏试验结果见表５。结果表明，两种方法均为敏感３４例，耐药结果相同３例（其
中，耐两药１例，多重耐药２例），两法结果完全相符３７株，
符合率５６．９％（３７／６５），２８株结果不符。以比例法药敏试验为
判断标准，则液体快速培养法检测各种药物耐药性的阳性预
期值（ＰＰＶ）、阴性预期值（ＮＰＶ）和准确率见表６。
表５６５株临床结核分枝杆菌比例法，液体变色培养法药物敏感性结果比较
表６６５株液体快速培养法以比例法为标准的结果评价（％）
２．３快速液体培养法药敏试验培养时间观察
按试验方法要求对照管变色表示已生长，１００株试验菌
株生长天数见表７，其中２ｄ内生长２株，均为非分枝杆菌，４～７ｄ内合计９５％的菌株生长。
表７１００株试验菌生长天数与菌株数的关系
３讨论
分枝杆菌快速变色液体培养基在国外已有了较为广泛
的应用［１］，国内熊礼宽等［２］也做了较为深入的研究，但在基层
结核病实验室临床应用和推广国内尚无经验。我们首次在基
层结核病实验室将分枝杆菌快速变色液体培养基培养、药敏
方法与经典罗氏培养、药敏方法进行对照试验，并取得了较
为理想的试验结果。显示出分枝杆菌快速变色液体培养及药
物敏感性试验具有快速、简便、经济、阳性率高、较高准确性
的优点。生长天数（ｄ）１２３４５６７８９１０菌株数（株）１１０２３２５３６１１１１１ＳＭＩＮＨＲＦＰＥＢ药物种类ＰＰＶ８０．０（１２／１５）８８．８（１６／１８）８６．６（１３／１５）８４．６（１１／１３）ＮＰＶ７５．０（１５／２０）７０．５（１２／１７）９０．０（１８／２０）９５．０（１９／２０）准确率７７．１（２７／３５）８０．０（２８／３５）８８．６（３１／３５）８５．７（３０／３５）
涂片镜检变色液体培养Ｌ－Ｊ培养方法痰标本数２００２００２００阳性数７９（３９．０）９８（４９．０）９３（４６．５）阴性数１２１（６１．０）１０２（５１．０）１０７（５３．５）污染数０９（４．５）８（４．０）ＳＭＩＮＨＲＦＰＥＢ药物种类ＰＰＶ５７．１（４／７）５７．１（４／７）６０．０（３／５）１００．０（２／２）ＮＰＶ７２．４（４２／５８）７４．１（４３／５８）９０．０（５４／６０）９６．８（６１／６３）准确率７０．７（４６／６５）７２．３（４７／６５）７２．３（４７／６５）９６．６（６３／６５）耐药敏感液体变色培养基测定法耐药敏感４３１６４２耐药４３敏感１５４３耐药３２敏感６５４耐药敏感２０２６１ＳＭＩＮＨＲＦＰＥＢ比例法
