人甲胎蛋白异质体3AFPL3酶联免疫分析试剂盒使用方法

授课对象：06级检验1-5班
课时：2学时
甲胎蛋白（AFP）测定
目标：1.掌握ELISA法测定AFP的原理及注意事项
2.熟练地进行AFP测定
3.了解AFP测定的主要临床意义
实验用品：AFP测定试剂盒、酶标仪
内容：
原理：
本试剂盒采用针对抗原不同，决定簇的双单克隆抗体分别制备成包被板和酶结合物，利用ELISA双抗夹心法原理检测人血清中AFP含量。

操作步骤：
1. 加样：将包被孔编号，留1孔作空白对照，其余孔用微量加样器依次加入标准及待测样品各100ml。

2．孵育：置37℃温育30min。

3．洗涤：甩去孔内液体，在各孔内加入洗涤液2滴，轻轻震荡3~5次，
弃之，然后用蒸馏水加满各孔，甩掉；反复5次最后在吸干纸上拍干。

4．加酶结合物：每孔加入酶结合物100ml，空白孔不加。

5．置37℃温育15min。

6．重复步骤“3”。

7．显色：每孔加入底物50μl，再加显色剂50μl，充分混匀，室温避光反应2~5min。

8．终止：每孔加终止液50μl，终止反应。

参考范围：0~20 μg/L
注意事项：
1．操作前请仔细阅读说明书，应严格控制反应温度和时间。

2．试剂盒使用前要充分恢复到室温。

3．洗涤要彻底，防止假阳性，但不可洗涤过猛过急，而致假阴性。

课后小结：。

甲胎蛋白异质体比率（AFP-L3%）临床应用价值解析甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是目前临床应用最广泛的肝癌辅助诊断血清标志物。

AFP诊断肝癌的敏感性为60%～70%，但在肝脏良性疾病，特别是肝癌高危人群，如慢性肝炎、肝硬化中也有部分患者会出现AFP升高。

妇女孕期及某些生殖系统疾病AFP也会升高。

AFP是一种单链糖蛋白，根据其与小扁豆凝集素（Lens culinaris agglutinin，LCA）的亲和力从低到高依次分为AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3。

AFP-L1主要见于良性肝病，AFP-L2主要由卵黄囊产生并多见于孕妇，而AFP-L3主要来源于肝癌细胞，也被称为甲胎蛋白异质体。

中国、日本及亚太肝癌诊疗指南中均将AFP作为肝癌的监测指标。

日本肝病学会（Japan Society of Hepatology，JSH）制定的肝癌诊疗指南中建议将AFP、AFP-L3和异常凝血酶原[脱γ羧基凝血酶原（des-gammacarboxyprothrombin，DCP），又称维生素K缺乏或拮抗剂Ⅱ诱导的蛋白质（protein induced by vitamin K absence or antagonistⅡ，PIVKAⅡ）]同时作为肝癌筛查的标志物，并建议高危人群每6个月做一次超声检查及AFP/AFP-L3/DCP检测以筛查肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），超高危人群及预后随访则建议每3～4个月进行1次AFP/AFP-L3/DCP及影像学检查。

我国原发性肝癌诊疗规范（2011年版）中指出：血清AFP及其异质体是诊断肝癌的重要指标和特异性最强的肿瘤标志物，国内常用于肝癌的普查、早期诊断、术后疗效监测和随访，且有助于鉴别肿瘤的来源。

尽管美国肝病学会（American Association for the Study of Liver Diseases，AASLD）并未将血液标志物纳入临床肝癌诊疗指南，但美国食品与药品监督管理局（U.S. Food and Drug Administration，FDA）已于2005年批准AFP-L3检测试剂和方法用于临床肝癌预警。

1前言甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是一种单链糖蛋白。

1970年Purves对肝癌患者血清作凝胶电泳时最先观察到AFP有不同的迁移率，因此提出甲胎蛋白异质体（alpha-fetoprotein variants）这一概念［1］。

随着生物化学及其相关分析技术的发展，研究人员发现不同来源的AFP，其糖链的组成和构型存在差异。

不同的植物凝集素能够特异性地识别一定的糖基，并与之结合。

根据与外源性凝集素亲和性的不同，可对AFP 的来源作出判断。

Taketa等［2］发现原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者血清中AFP与小扁豆素（lens culinaris agglutinin，LCA）结合后，电泳分成三带，依次命名为AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3，即LCA非结合型（AFP-L1、AFP-L2）和LCA结合型（AFP-L3）。

对比分析显示HCC患者AFP-L3比率比其它良性肝病患者明显升高。

现通常把与小扁豆素结合的AFP-L3称为AFP异质体，它是新一代的肿瘤标志物［3］。

2甲胎蛋白异质体（AFP-L3）检测的临床意义AFP属于胚胎性蛋白，是应用最广泛的肿瘤标志物。

大量研究证实，AFP分子的糖链异质性与其组织器官来源有关，不同生理病理状况可产生不同糖链结构，并且具有肿瘤特异性。

血清总AFP所含AFP-L1来自良性肝病，占其主要部分；AFP-L2来自孕妇；而AFP-L3则为肝癌细胞特有，AFP-L3>15%即可诊断为原发性肝癌。

AFP-L3诊断肝癌的敏感性为96.9%，特异性为92.0%，准确性为95.5%［4］。

AFP-L3值与总AFP 值无相关性，是独立于总AFP值的肝癌诊断因子［5］，是目前公认的肝癌鉴别诊断和早期诊断的指标，具有非常重要的临床意义［6］。

3甲胎蛋白异质体的检测技术测定AFP-L3常用的方法，是根据AFP异质体对植物凝集素（如小扁豆凝集素LCA、刀豆素ConA或豌豆凝集素PSA）结合能力的不同进行分离，然后应用免疫学方法进行定量测定。

常见的甲胎蛋白异质体1. 甲胎蛋白L3（AFPL3）：这是一种糖基化程度较高的甲胎蛋白异质体，通常与肝癌相关。

研究表明，AFPL3在肝癌患者中的水平显著高于其他类型的甲胎蛋白异质体，因此被用作肝癌诊断和监测的指标。

2. 甲胎蛋白R（AFPR）：这是一种糖基化程度较低的甲胎蛋白异质体，与肝细胞癌（HCC）和生殖细胞肿瘤相关。

AFPR在HCC患者中的水平升高，可以作为HCC的诊断和预后指标。

3. 甲胎蛋白γ（AFPγ）：这是一种糖基化程度较高的甲胎蛋白异质体，与肝癌和生殖细胞肿瘤相关。

AFPγ在肝癌患者中的水平升高，可以作为肝癌的诊断和监测指标。

4. 甲胎蛋白β（AFPβ）：这是一种糖基化程度较低的甲胎蛋白异质体，与生殖细胞肿瘤相关。

AFPβ在生殖细胞肿瘤患者中的水平升高，可以作为生殖细胞肿瘤的诊断和监测指标。

5. 甲胎蛋白α（AFPα）：这是一种糖基化程度较高的甲胎蛋白异质体，与肝癌和生殖细胞肿瘤相关。

AFPα在肝癌和生殖细胞肿瘤患者中的水平升高，可以作为这两种疾病的诊断和监测指标。

6. 甲胎蛋白δ（AFPδ）：这是一种糖基化程度较高的甲胎蛋白异质体，与肝癌相关。

AFPδ在肝癌患者中的水平升高，可以作为肝癌的诊断和监测指标。

7. 甲胎蛋白ε（AFPε）：这是一种糖基化程度较低的甲胎蛋白异质体，与肝癌和生殖细胞肿瘤相关。

AFPε在肝癌和生殖细胞肿瘤患者中的水平升高，可以作为这两种疾病的诊断和监测指标。

8. 甲胎蛋白ζ（AFPζ）：这是一种糖基化程度较高的甲胎蛋白异质体，与肝癌相关。

AFPζ在肝癌患者中的水平升高，可以作为肝癌的诊断和监测指标。

9. 甲胎蛋白η（AFPη）：这是一种糖基化程度较低的甲胎蛋白异质体，与肝癌和生殖细胞肿瘤相关。

AFPη在肝癌和生殖细胞肿瘤患者中的水平升高，可以作为这两种疾病的诊断和监测指标。

10. 甲胎蛋白θ（AFPθ）：这是一种糖基化程度较高的甲胎蛋白异质体，与肝癌相关。

酶联免疫试验操作方法酶联免疫试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测样本中特定抗原或抗体的存在与数量。

ELISA方法的原理是将特定的抗原或抗体与检测物质打标记，然后通过可以与标记物结合的特异性抗体反应来检测目标物质的存在与浓度。

下面将介绍ELISA的操作方法。

1. 试剂准备：(1) 底物：将所需底物溶于缓冲液，根据实验需求选择适当的底物，如TMB、ABTS等。

(2) 酶标记抗体：将所需的酶标记抗体充分稀释至适当浓度，通常为1:1000至1:10000。

(3) 试样：将待测样品按照需要进行稀释或处理。

如果检测抗体，则需将样品加入酶标记抗体反应，在室温下孵育。

(4) 洗涤缓冲液：常见的洗涤缓冲液为PBS-T（含有Tween 20）。

准备好PBS-T或其他适当的洗涤液，以用于洗涤步骤。

(5) 制备标准曲线：根据实验需求，选择适当的标准品并制备浓度梯度的标准曲线。

2. 板涂覆：(1) 取出ELISA板，将所需抗原或抗体稀释至适当浓度，加入每个孔中。

每个样品需设置多个平行孔，以进行可靠的实验结果分析。

(2) 封闭非特异性结合位点：将孔板封闭，并将其置于37C恒温箱中孵育1至2小时。

3. 底物-标记物结合：(1) 倾倒每个孔的液态，并在每个孔中分别加入酶标记的抗体。

通过抗体与抗原或抗体结合，在孔中形成免疫复合物。

(2) 将孔板置于恒温箱中，在室温下孵育1至2小时，促使免疫反应的发生。

4. 孔洗涤：(1) 将液体倾倒，然后用洗涤缓冲液充分洗涤每个孔，以去除未结合的抗体。

(2) 每孔洗涤的次数及洗涤时间依实验需求而定，通常为3至5次，每次洗涤持续约30秒。

5. 底物反应：(1) 将稀释好的底物加入每个孔中，底物与酶标记结合物质反应，形成可见的颜色变化。

(2) 在室温下进行底物反应，反应时间依抗体的检测结果而定，通常为15分钟至1小时。

AFP检测——ELISA法【申请单】×××市人民医院检验申请单姓名性别年龄门诊号住院号诊断或症状检验标本检验目的送检科室医师送检日期年月日【方法选择】方法电化学发光法ELISA法RIA法本次检查选择√【材料准备】1.人甲胎蛋白（AFP）ELISA定量检测试剂盒。

2.受检者血清。

3.水浴箱/37℃恒温箱。

4.加样枪。

5.酶标仪。

【操作方法】按试剂盒使用说明书或实验室制定的SOP进行操作，主要操作流程如下：1.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2.温育：用封板膜封板后置 37℃温育30分钟。

3.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

4.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

5.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

6.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 分钟.7.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

8.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。

测定应在加终止液后15分钟以内进行。

【结果计算】以标准品浓度（ng/ml）为横坐标，OD值（450）为纵坐标，绘制标准曲线。

根据待测样品的OD值，计算出待测样品中AFP的实际浓度。

【参考区间】1.正常人血清AFP<20ng/ml。

2.由于ELISA法受人工因素干扰大，重复性相对较差，因此在每次测量时都要加标准品做标准曲线。

【注意事项】1.标本的采集和保存血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血，避免细菌污染，血清标本宜在新鲜时检测，一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超过1周测定的需低温冰存。

人免疫球蛋白酶联免疫分析试剂盒使用方法本试剂盒仅供研究使用。

检测范围：96T2.5μg/ml -80μg/ml使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中免疫球蛋白含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人免疫球蛋白水平。

用纯化的抗-IgG抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入免疫球蛋白，再与HRP标记的羊抗人抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的免疫球蛋白呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人免疫球蛋白浓度。

标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。