宋向容-外泌体研究进展介绍

Exosome研究的应用
细胞外囊泡(Evs) 也叫作： exosomes microvesicles
图1. EV介导的促肿瘤生长、侵袭和转移效应
图2. 体内分析EV介导物质和信息传 递的方法
人们通常用外泌体这个术语指定他们所分析的EVs。 在文献中最常用的外泌体提取方法（差速超速离心，220纳米过滤） 以及最近开发的试剂 盒，都会将不同类型的EVs一起分离出来。 外泌体这术语一般是用来指小EVs（SEVS）的混合类群 研究发现的外泌体功能可能是反映泛EV的功能也可能是特定的外泌体的功能；目前发表的 数据并不能用来确定其精确特异性。 Thery使用通用术语EVs来概述外泌体及细胞外囊泡的最新进展。
Exosome研究的应用 ----恶棍使者：肿瘤细胞通过释放器官倾向性小膜泡帮助
肿瘤转移
肿瘤转移的两种观点：
传统的观点认为，原发肿瘤细胞进入血液，少数细胞会扩散到远处器官中，如肺等。这些细 胞再生长成新的肿瘤。另一种观点是，原发肿瘤释放包含蛋白质和RNA的微小膜泡——外泌 体来帮助肿瘤细胞在转移灶扎根并招募骨髓细胞来协助。这种被外泌体改变的“转移前微环 境”将滋养后来到达的肿瘤细胞。
• • •
外泌体(Exosome)简介
根据外泌体数据库Exocarta(http://www.exocarta.org)最新的数据显 示，不同组织细胞所产生的外泌体中含有9000多种蛋白，1000多 种脂质体,3000多种mRNA和2800多种miRNA
外泌体所含核苷酸：
• • • • • 外泌体所具有的可以将其与其它生物囊泡区分开来的一大特征 就是含有大量的核苷酸，包括： MicroRNAs( miRNAs) 和mRNA。 同时含有线粒体DNA(mtDNA)，piRNAs， 长链非编码RNA(lncRNAs)， 核糖体RNA(rRNAs)和snRNAs, snoRNAs和tRNAs
外 泌 体 的 特 征
明显的双层膜 大小不一的茶托样结构
外泌体的提取方法
目前大家分离外泌体主要通过以下手段：
差速超速离心法 过滤离心法 梯度密度离心法 沉淀试剂盒 凝胶排阻分离法 膜亲和试剂盒 免疫磁珠法 色谱法等
主要用于同时分离所有的胞外囊泡组分
梯度密度离心的分离方法是公认可以得到最高纯度， 但是操作相对复杂，目前使用并不广泛。 以目前的手段来说，很难拿到纯的外泌体组分，多 是以外泌体为主要组分的胞外微囊泡，
Exosome研究的应用
-------血液检验
从患者血液中取得的微泡包含足够的RNA用来分析和作为诊断使 用。 基于外泌体RNA的分析诊断是一种创伤小的速效方案，可替代 传统需要肿瘤活组织检查的免疫荧光或免疫组织化学检验方 法。 以外泌体为基础的诊断使得在癌症病情发展过程中可及时监测 分子标志物的变化，这种基于血液样本的检测比重复的组织活 检更容易监控，样本更容易收集。
外泌体(Exosome)简介
外泌体中包含了多种多样来源于其分泌细胞的成分，包括： • 蛋白 • 脂质体( lipids) 、 • mRNA • microRNA(miRNAs） 外泌体由多种类型的细胞分泌（几乎所有的细胞类型） • 树突状细胞 淋巴细胞 肥大细胞 • 上皮细胞 内皮细胞 • 神经元 神经胶质细胞 • 干细胞 • 肿瘤细胞等
Exosome研究的应用 ------肿瘤标志物
• • 随着肿瘤研究的不断深入，肿瘤细胞特异性标志物已逐渐成为肿瘤诊 断中必不可少的检测项目。 常规的肿瘤标志物筛查可能需要进行组织活检，通过穿刺等方式取得 病人活体样本。
外泌体(Exosome)简介
根据外泌体数据库Exocarta(http://www.exocarta.org)最新的数据显 示，不同组织细胞所产生的外泌体中含有9000多种蛋白，1000多 种脂质体,3000多种mRNA和2800多种miRNA
外泌体所含脂质：
• 如胆固醇、甘油二酯、鞘磷脂和神经酰胺、磷脂、磷脂酰胆碱 (PC ) 、磷酯酰丝氨酸(PS ) ， 磷脂酰乙醇胺(PE ) 、磷脂酰肌醇 (PI) 和聚甘油。 外泌体所含脂质与其来源细胞所含脂质有一定的差异。 外泌体所含鞘磷脂、PS、PI、神经酰胺和胆固醇的比例都较其 来源细胞所含比例高。 相反，外泌体所含PC比例较来源细胞所含比例低。
这仍然是一个开放的领域。关于外泌体和肿瘤转移的关系尚未被完全证明，距 离人类疾病和治疗的相关性还差得很远 Kaiser, J. (2016). "Malignant messengers." Science 352(6282): 164-166.
Exosome研究的应用
外泌体为器官特异性转移做准备 A 外泌体从原发肿瘤的细胞中释放出来，入血液，把蛋白质、脂质和核酸运输到身体远端的细胞中。研 究发现不同肿瘤细胞分泌的外泌体表面的整合素不同。整合素的类型决定了外泌体粘附的细胞类型。 整合素 α6β4 和 α6β1在肺转移中起关键作用，整合素 αvβ5 在肝转移中起关键作用。 B 外泌体的内含物会引起目标器官的细胞变化，从而为癌症转移做准备。外泌体引导其来源癌细胞进入 特定器官，促进肿瘤细胞发生器官特异性的转移和增殖。
Exosome研究的应用
---尿液中的外泌体
肿 瘤 诊 断
全球首个也是目前唯一一个无需直肠指检的利用简单尿液样本 收集外泌体分析其遗传信息的液体活检测试，可能可以避免全 世界每年超过一百万例的不必要的前列腺活检（图）
EPI是第一个使用从简单的尿样捕获特异性遗传信息的测 试，可为医生提供一个评分，以帮助评估他们的病患高 分级、更具侵袭性前列腺癌的风险。
Sheridan, C. (2016). "Exosome cancer diagnostic reaches market." Nat Biotechnol 34(4): 359-360. IF= 41.514
Exosome研究的应用
肿瘤遗留在血液里的踪迹——外泌体
• • • 液体活检的优点在于方便快捷、微创痛苦，并且它可让医生密切监测肿瘤的 治疗效果，预测癌症复发。 从长远来看，临床医生甚至可能使用液体活检在肿瘤的最早阶段，在还没有 显示任何症状时发现肿瘤。 血液循环中的DNA基因组信息可能提供人体癌症基因的快照，甚至可能据此 找出癌症起源的地方。
外泌体(Exosome)简介
首先，在胞外环境刺激下，细胞发生内吞，其细胞膜向内凹陷出芽形成一个封闭的囊泡，称为早期胞内体 ( early endosomes) ，随后早期胞内体逐渐成熟为晚期胞内体( late endosomes) 。在此过程中，其膜再次向内出 芽并脱 落，形成一系列内囊泡( intraluminal vesicles,ILVs) 将细胞质基质中相应的蛋白质与核酸选择性包裹其中。这种含 有许多囊泡的胞内体称为多囊泡胞内体( multi-vesicular endosomes,MVBs) 。MVBs 有两种去向，一部分通过与 溶酶体融合，其内含物被溶酶体中的酸性水解酶降解; 另一部分则在相应刺激下与细胞膜融合，从而将内部囊 泡释放到细胞外。这种从MVBs 释放到细胞外的膜性小囊泡即称为外泌体
Exosome研究的应用
图2. 体内分析EV介导物质和信息传递的方法
Tkach, M. and C. Thery (2016). "Communication by Extracellular Vesicles: Where We Are and Where We Need to Go." Cell 164(6): 1226-1232. IF=32.24
外泌体研究进展介绍
广东省职业病防治院 宋向荣
内容
• 外泌体简介 • 外泌体提取方法 • ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ泌体研究的应用
外泌体(Exosome)简介
• 是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡， 具有脂质双层膜结构，直径大约40-100 nm （或30-100nm）。 1983年在绵羊网织红细胞中被发现，认为 是一种细胞性的废弃物。 1987年，Johnstone 首次提出外泌体 （exosomes）这一个概念 1996年发现与抗原递呈然反应有关，参与 免疫系统的生物免疫作用。 2007年，发现这种微小膜泡中含有细胞特 异的蛋白、脂质和核酸包括mRNA和miRNA 等，能作为信号分子传递给其他细胞从而 改变其他细胞的功能。
Her2/Neu---卵巢癌腹水 Martl------黑色素瘤
外泌体(Exosome)简介
外 泌 体 的 特 征
Thery在2006年发表的外泌体分离鉴定手册上的图样。 电镜视野中大多是略小于100nm的具有清晰膜的茶托样结构。 小图中显示免疫胶体金会附着到这些膜结构表面。
外泌体(Exosome)简介
Tkach, M. and C. Thery (2016). "Communication by Extracellular Vesicles: Where We Are and Where We Need to Go." Cell 164(6): 1226-1232. IF=32.24
Exosome研究的应用
外泌体(Exosome)简介
根据外泌体数据库Exocarta(http://www.exocarta.org)最新的数据显 示，不同组织细胞所产生的外泌体中含有9000多种蛋白，1000多 种脂质体,3000多种mRNA和2800多种miRNA
外泌体所含蛋白：
大多数与细胞内吞网络相关，最常被鉴定的蛋白质为： 膜转运蛋白 和融合蛋白 GTPases annexins flotillin 热休克蛋白 HSP70 HSP90 四跨膜蛋白超家族成员 CD9 CD63 CD81 CD82 多泡体生物合成相关蛋白 TSG101 Alix 细胞骨架蛋白 actin（肌动蛋白） tubulin（微管蛋白） 油脂相关蛋白和磷脂、代谢相关的酶类 信号转到蛋白、载体蛋白、组织相容性抗原 CD63 等，为外泌体的标记蛋白，用于外泌体的鉴定
100％的准确率和敏感性诊断出早期和晚期胰腺癌
• 2016年1月，全球首个基于外泌体的癌症诊断产品于美国 上市，位于马萨诸塞州剑桥市的Exosome Diagnostics公司推 出的这一液体活检产品标志着新兴的外泌体生物学向成熟 迈进了一步。
Sheridan, C. (2016). "Exosome cancer diagnostic reaches market." Nat Biotechnol 34(4): 359-360. IF= 41.514
Exosome研究的应用
• 2008年，波士顿的马萨诸塞州Johan Skog，发现外泌体可 以通过转移miRNA与血管生成相关蛋白促进肿瘤的生长， 这些还可以提供基于血液的诊断信息。 • 2015年，发现细胞表面蛋白多糖磷脂酰肌醇聚糖-1（GPC1） 在胰腺癌个体血液外泌体中含量特别丰富。GPC1能够以
• • • •
外泌体(Exosome)简介
• 细胞在正常和病理状态下均可分泌外泌体。 其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形 成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜 融合后释放到胞外基质中 。 • 外泌体内含物成分与其细胞来源有关，他 们就像亲本细胞生产的产品 • 体内存在的广泛性和获取的便捷性，外泌 体作为一个新型的研究热点，已经成为了 疾病诊断治疗的潜在有效方式，在精准医 学发展上有着光明的前景。
图1. EV介导的促肿瘤生长、侵袭和转移效应
Tkach, M. and C. Thery (2016). "Communication by Extracellular Vesicles: Where We Are and Where We Need to Go." Cell 164(6): 1226-1232. IF=32.24
外泌体(Exosome)简介
外 泌 体 的 特 征
• 脂双层膜的囊状结构 • 通过不同浓度梯度的超高速离心所获得的外泌 体电子显微镜下观察呈杯状形态。 • 存在多种细胞，包括肿瘤细胞。 • 存在多种体液中，如血液、尿液、唾液、乳汁、 支气管肺泡灌洗液、羊水、脑脊液、腹水等。 • 存在大多数种类细胞的培养液中。 • 表面存在有相同特征的标记蛋白。 • 不同细胞来源的外泌体所含的生物分子具有细 胞种属特异性。