外泌体蛋白质组学研究进展_图文(精)

临床检验杂志2016年12月第34卷第12期Chin J Clin Lab

Sci,Dec.2016,V01.34,No.12

DOI:10.13602/ki.jcls.2016.12.11

外泌体蛋白质组学研究进展宰

・927・・综述・

覃思华,郑磊(南方医科大学南方医院检验科,广州510515

摘要:外泌体(exosome是一类由体内多种活细胞分泌的纳米级的双层膜结构小囊泡。可携带包含亲代细胞信息的核酸、蛋白质和脂质等。大多数外泌体有特殊的功能,可能与细胞信号转导功能相关。现已发现外泌体参与疾病进展、肿瘤血管生成、免疫监视等多个环节。外泌体中蛋白质是参与疾病发生、发展的重要部分。该文总结外泌体蛋白质组学的研究思路及方法, 综述目前外泌体蛋白质的临床作用,并对外泌体蛋白质组学研究面临的挑战和前景进行分析与评述。

关键词:外泌体;蛋白质组学;疾病

中图分类号:R446文献标志码:A

20世纪80年代,Johnstone等¨1发现网织红细胞在成熟过程中分泌的小囊泡可以传递转铁蛋白,并首次将这种囊泡亚型命名为exosome(即外泌体。外泌体可通过传递信息影响靶细胞的功能,激活细胞信号通路,在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用。而其中蛋白质差异表达是区分不同来源外泌体的重要特点,是研究外泌体起源的重要途径旧J。与核酸相比,外泌体蛋白质的差异表达更难被检测出来,并且常规的分离方法极易携带蛋白质污染,是外泌体蛋白质组学研究主要面临的难题,也限制了蛋白质研究的发展。但是,随着蛋白质组学技术的快速更新,外泌体特异蛋白质的研究将具有巨大的前景。

1外泌体及其结构功能

外泌体是细胞进化过程中内出芽形成的多泡体释放的一类直径为30~100am的脂质双层膜的小囊泡,可由各种类型的细胞分泌,也可在各种体液中分离出来,包括血液、尿液、唾液、滑膜液、乳汁、脑脊液等。外泌体携带着大量的细胞特异的生物活性分子,如核酸、蛋白质、脂类和糖类等,这些物质经过亲代细胞选择和特殊包装而进入外泌体,是激发信号转导机制的关键,在机体很多生理病理过程中发挥重要的作用,如免疫调节[3J、动脉粥样硬化H o、肿瘤药物抵抗垆1、抗病毒㈣等。

外泌体起源于胞内体途径。细胞内吞的囊泡被分类并到达溶酶体和细胞膜。瑚J。早期核内体与细胞内吞的囊泡融合,将囊泡中回收、退化或胞外分泌的部分吸收,成为再生的早期核内体。这些核内体经历一系列转化后成为晚期核内体。在此转化过程中,晚期核内体逐渐形成多泡小体(mul-tivesicular bodies,MVBs,而其中30~100nln的囊泡从多泡小体的管腔出芽一J。多泡小体可以与溶酶体融合,参与溶酶体途径,或参与分泌途径,与质膜融合¨1。溶酶体途径将导致内容物降解,而分泌途径中形成外泌体释放到细胞外微环境。以上一系列从核内体复合物到外泌体的形成过程需要内体分选转运蛋白复合物(ESCRT和其他相关蛋白质如 Alix[7]。外泌体是由胞外分泌产生的,不同的脂质与脂质相关的酶也控制着外泌体的分泌过程¨…。也有的理论强调胞质蛋白半乳凝集素5(galectin-5参与了核内体和外泌体的释放¨1。,所以蛋白质对于外泌体的产生和发挥生理功能都有着重要作用¨“。

目前的研究常以外泌体蛋白在细胞中的定位进行分类。外泌体中细胞质蛋白最丰富,在体液中可达47%,在细胞上清中为43%,其次是膜蛋白(体液和细胞上清中分别为28%和34%,核酸和线粒体蛋白则较低,大部分的膜蛋白和细胞质蛋白在外泌体中较保守,这在不同来源的外泌体中均已被证实¨3|。另一种分类方法主要将蛋白质分为两大类。一类是非特异性蛋白质,大部分是来源于亲代细胞中保守区域的细胞质和膜蛋白,如细胞骨架蛋白[肌动蛋白(actins、微管蛋白(tubulins、埃兹蛋白(ezrin、膜突蛋白(moesin],新陈代谢相关的酶[磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH、烯醇化酶1 (enolase 1、磷酸甘油酸激酶1(PGKl、丙酮酸激酶2 (PKM2],核糖体蛋白,跨膜蛋白[多聚免疫球蛋白受体 (PIGR、溶酶体相关膜蛋白1(LAMPl、CD59],膜联蛋白(annexins,热休克蛋白,粘附蛋白[整合素(integrin8、乳腺肪球因子8(MFGE8]等,这些

蛋白质可能参与上述的外泌体的合成过程。另一类则是不同来源外泌体的特异性蛋白质,经质谱研究发现其携带了4400余种特异性蛋白质¨“。这类蛋白质可能与细胞信号转导功能相关,在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用,在不同的生理病理条件下有表达差异,因此更具备生物学标志物的潜力。体液中的外泌体蛋白质受血液高丰度蛋白质干扰少、表达稳定,使其较血液中传统的可溶性诊断分子更有意义。外泌体还携带了特异的信息,介导疾病的发生发展,具有作为生物学标志物的潜力。

2外泌体的分离及鉴定

2.1外泌体的分离和纯化外泌体蛋白质组学研究的前提是获取均匀的无污染的囊泡蛋白产物,故要排除病毒、杂蛋白和外泌体聚集等影响。不同提取方法获得外泌体的回收率、纯度和颗粒完整性差异较大,目前仍缺乏统一标准的分离方法¨“。Lobb等¨刮对蔗糖密度梯度离心法、差速超速离心法、尺寸排阻(size exclusion isolation,SEC法、沉淀法、超

木基金项目:国家自然科学基金(81371901;广州市科技计划资助项目(1563000220;广州市健康医疗重大专项(201604020015。作者简介:覃思华,1991年生,女,技师,硕士,研究方向:细胞外囊泡作为疾病诊断标志物。

通信作者:郑磊,教授,博士,E・mail:nfyyzhenglei@.C11。

万方数据

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滤法获得的产物进行了初步的表征分析,提出使用每微克蛋白质的颗粒浓度来衡量分离产物的纯度,结果发现沉淀法的回收产率最高但纯度最低,提示得到的产物中有大量的蛋白质并不属于外泌体;超高速离心可能会造成较大损耗,也损伤囊泡,导致分离效果稳定性差;而血浆外泌体分离SEC法产物纯度可与超速离心法相媲美,甚至高于蔗糖密度梯度离心法。也有一些研究以外泌体表面标志蛋白质为基础,利