下载文档原格式
水稻花粉管通道法摘要水稻花粉管通道法是一种高效、实用的遗传转化方法，广泛应用于水稻遗传改良。
本文介绍了水稻花粉管通道法的原理、技术流程、优缺点以及应用前景，以期为相关研究提供参考。
一、引言水稻是全球重要的粮食作物之一，对人类生活和经济发展具有重要意义。
为了提高水稻产量和品质，科学家们不断探索新的遗传改良方法。
其中，花粉管通道法是一种具有广泛应用前景的遗传转化方法。
二、原理花粉管通道法的基本原理是利用植物的花粉管通道，将外源基因导入植物受精卵中，实现基因的转移和表达。
在花粉与卵细胞结合形成受精卵的过程中，花粉管会穿过卵细胞壁，与卵细胞融合。
此时，外源基因可以通过花粉管通道进入受精卵，并随受精卵的发育而表达。
三、技术流程1. 基因构建：首先，将目标基因与合适的载体连接，构建成表达载体。
2. 载体转化：将构建好的表达载体导入植物细胞或原生质体中，获得转基因细胞或原生质体。
3. 细胞培养：将转基因细胞或原生质体进行培养，筛选出转化成功的细胞或原生质体。
4. 植株再生：将转化成功的细胞或原生质体培养成植株，并进行表型鉴定和分子检测。
5. 遗传稳定性检测：对转基因植株进行多代繁殖，检测其遗传稳定性。
四、优缺点1. 优点：花粉管通道法具有操作简便、转化效率高、适用范围广等优点。
此外，该方法不需要组织培养和病毒载体等辅助手段，降低了实验成本和操作难度。
2. 缺点：花粉管通道法也存在一些缺点，如转化过程中可能存在基因沉默现象、转化植株的遗传稳定性有待进一步验证等。
此外，该方法对环境可能产生一定影响，需要加强安全性和可持续性方面的研究。
五、应用前景随着基因编辑技术的发展和应用，花粉管通道法在基因功能验证、新品种培育等方面具有广阔的应用前景。
未来，科学家们可以进一步优化花粉管通道法技术流程，提高转化效率和安全性，为水稻遗传改良提供更加高效、实用的方法。
同时，随着人们对食品安全和环境保护意识的提高，对转基因作物的监管和审批也将更加严格。
植物学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ２００８， ２５ （３）： ３２２−３３１， ｗｗｗ．ｃｈｉｎｂｕｌｌｂｏｔａｎｙ．ｃｏｍ收稿日期： ２００７－０６－２０； 接受日期： ２００７－１１－０９基金项目： 国家自然科学基金（Ｎｏ． ３０６７０１８５）＊ 通讯作者。
Ｅ－ｍａｉｌ： ｃｈｏｎｇｋ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ．技术与方法．一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效基因转化系统陈惠１， ２， 赵原１， 种康１＊１中国科学院植物研究所， 光合作用与环境分子生理学重点实验室， 北京 １０００９３２山西师范大学生命科学学院， 临汾０４１００４摘要 以成熟胚愈伤组织为材料的农杆菌介导水稻转化法虽已建立， 但转化频率仍有待提高。
本文以粳稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）品种（中花１０号和中花１１号）的成熟胚诱导的愈伤组织为受体材料， 对组织培养体系及影响遗传转化的因素进行优化， 建立了一套改进的农杆菌介导的水稻高效遗传转化系统。
农杆菌菌株为ＥＨＡ１０５， 质粒载体是ｐＵＮ１３０１／ ＯｓＲＡＡ１， 其中含有标记基因ＧＵＳ 和筛选基因ＨＰＴ。
愈伤组织诱导培养基为ＮＢＤ２ （ＮＢ＋２ ｍｇ·Ｌ－１２，４－Ｄ）， 继代培养基为ＮＢＤ０．５， 预分化与分化培养基为ＲＥ１ （ＭＳ＋１ ｍｇ·Ｌ－１６－ＢＡ ＋ ０．２５ ｍｇ·Ｌ－１ ＮＡＡ ＋ ０．５ ｍｇ·Ｌ－１ ＫＴ ＋ ０．２ ｍｇ·Ｌ－１ ＺＴ）和ＲＥ２ （ＭＳ＋ １ ｍｇ·Ｌ－１ ６－ＢＡ ＋ ０．５ ｍｇ·Ｌ－１ ＮＡＡ＋ ０．５ ｍｇ·Ｌ－１ ＫＴ ＋ ０．２ ｍｇ·Ｌ－１ ＺＴ）。
另外， 还分析了影响Ｔ－ＤＮＡ转移的多种因素， 如外植体种类、愈伤组织预培养基和愈伤组织继代次数等。
采用优化的转化程序， 水稻愈伤组织转化率和植株转化率可达７０％以上。
农杆菌介导水稻遗传转化的相关讨论农杆菌介导水稻遗传转化相关的讨论羧苄青霉素的作用羧苄青霉素在农杆菌介导法对水稻进行遗传转化的过程中起到抑制农杆菌生长的作用。
根据前人的研究经验，浓度为250mg/L时候抑制效果最好且不会影响愈伤组织的再生。
本实验过程中我们发现，经过经验用量的羧苄青霉素抑制处理，转移至筛选培养基后一周左右即可见到少量愈伤农杆菌复发，有的甚至在第二次筛选时仍然生长出农杆菌，并未达到很好的抑制农杆菌生长的目的。
这有可能是在长期的实验过程和进化过程中，农杆菌对苏氨苄青霉素产生了耐受性。
因此，在遵循不影响愈伤组织生长的原则下，可以适当增加羧苄青霉素的用量，或者与头孢霉素配合使用，可以达到很好的抑制效果。
潮霉素作为筛选剂的最适宜浓度本实验采用潮霉素基因作为筛选标记，经过长期经验积累，发现潮霉素浓度梯度25mg/L,35mg/L和45mg/L进行多轮筛选，假阳性最低，筛选效果最好，为最适筛选浓度。
各个阶段不同添加物的作用水稻遗传转化过程中的碳源有多种选择，主要有葡糖糖，麦芽糖和蔗糖，糖类除作能源外,还可以作为渗透调节剂对愈伤组织的的质量起重要作用。
根据转化受体的不同，碳源的种类和浓度也有区别。
本实验室研究中发现，粳稻作为转化受体时，蔗糖为最佳的碳源，而在籼稻的遗传转化中，麦芽糖和蔗糖配合使用，效果最好。
植物激素是愈伤组织诱导和绿苗分化的关键性因素。
2 ,4-D 的质量浓度至关重要,对于愈伤组织诱导来说,低浓度及高浓度的2 ,4-D 都不适宜水稻成熟胚愈伤组织的诱导。
在籼稻的遗传转化中，2 ,4 -D与6 -BA 配合使用更有利于愈伤组织的诱导及分化。
潮霉素和除草剂均可以作为筛选剂。
适宜的筛选浓度有利有抗性愈伤组织的生长，潮霉素浓度过高，阳性愈伤组织也有可能被筛死，浓度过低，又会有较高的假阳性出现。
实验证明，只用潮霉素筛选所得的抗性愈伤和先用潮霉素筛选后用除草剂筛选所得的抗性愈伤，在分化再生过程中有显著差异。
华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University 2023, 44(6): 843-853DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202307001郭涛, 沈任佳, 王加峰. 水稻基因遗传转化方法研究进展[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(6): 843-853.GUO Tao, SHEN Renjia, WANG Jiafeng. Research progress on genetic transformation methods of rice[J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(6): 843-853.特约综述水稻基因遗传转化方法研究进展郭 涛 ，沈任佳，王加峰(华南农业大学 农学院/国家植物航天育种工程技术研究中心, 广东 广州 510642)摘要: 介绍水稻遗传转化方法的发展历程和科研成果，为水稻遗传转化体系的研究和应用提供借鉴。
从生物介导转化法和非生物介导转化法2类方法出发，介绍各种转化方法在水稻上的首次报道和重要进展并进行了展望。
生物介导转化法中，农杆菌Agrobacterium介导转化法通过侵染种胚、稻穗、愈伤组织和茎尖进行转化，种胚及其诱导的愈伤组织作为材料的转化体系较为成熟，稻穗和茎尖转化法则操作简便、转化再生周期短；此外，有研究尝试用根瘤菌Sinorhizobium和Rhizobium以及附着剑菌Ensifer adhaerens转化水稻。
非生物介导转化法中，物理方法转化法(基因枪法、电击法、花粉管通道法和显微注射法)是较为传统的转化方法，基因枪法应用较为成熟，花粉管通道法则取得较多育种成果；介质介导转化法中，纳米材料的应用正逐步成为研究热点。
水稻遗传转化体系的发展可从转化材料的筛选和优化介导转化的载体入手，同时将转化体系和DNA-free、单倍体诱导等技术结合起来，以提高转化效率和安全性，缩短转化再生周期。
直播稻金粳818成熟胚遗传转化体系的建立作者：李军玲张红磊张融雪蔡昱萌汪颖佟卉刘燕清苏京平来源：《安徽农业科学》2022年第09期摘要 [目的]建立高效的金粳818成熟胚遗传转化体系。
[方法]以直播稻品种金粳818成熟胚为外植体，设计4种诱导培养基，筛选适合金粳818的诱导条件;设计5种分化培养基，筛选适合金粳818的分化条件;获得的愈伤组织用农杆菌介导法进行转基因再生。
[结果]最佳诱导培养基为4.10 g/L NB+2 mg/L 2，4-D，诱导率为89.3%;最佳分化培养基为MS+5.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA，分化率为81.1%，成苗率为52.1%;经PCR分子检测，再生幼苗100%为转基因阳性植株。
[结论]该研究建立了金粳818成熟胚遗传转化体系，为品种定向改良奠定了技术基础。
关键词金粳818;成熟胚;愈伤组织;遗传转化中图分类号 S 511 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2022）09-0100-04doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.024开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Establishment of Genetic Transformation System of Mature Embryo of Direct Seeding Japonica Rice Variety Jingeng 818LI Jun-ling， ZHANG Hong-lei， ZHANG Rong-xue et al（Crop Research Institute， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding， Tianjin 300384）Abstract [Objective]To establish an efficient genetic transformation system of Jingeng 818. [Method]Using the mature embryo of direct seeding rice variety Jingeng 818 as explant， four induction medium schemes were designed to obtain the suitable induction conditions of Jingeng 818;five kinds of differentiation medium were designed to obtain the suitable differentiation condition for Jingeng 818; and the obtained callus was used to establish the transgenic regeneration system by agrobacterium mediated method. [Result]The results showed that the best induction medium was 4.10 g/L NB+2 mg/L 2，4-D with the induction rate 89.3%. The best differentiation medium was MS+5.0 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA with the differentiation rate 82.1% and the seedling rate 52.1%. By PCR molecular detection， 100% of the regenerated seedlings were transgenic positive plants.[Conclusion] In this study， the genetic transformation system of mature embryo of Jingeng 818 was established，which laid a technical foundation for directional improvement of varieties.Key words Jingeng 818;Mature embryo;Callus;Genetic transformation水稻是我國第一大口粮作物，水稻生产事关国家口粮安全。
农杆菌介导的水稻转化实验目的学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。
实验原理随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。
水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。
DNA直接导入法主要包括PEG（polyethylene glycol）介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。
其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。
基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大（上限是16-20kb），转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。
同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定（一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合），整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。
所以已成为转化单子叶植物的首选方法。
一、目标基因对农杆菌的转化1.1农杆菌感受态细胞的制备1.取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线，28℃黑暗培养。
2.挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16小时。
3.取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600=0.5。
在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。
这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存，而标记基因（尤其是抗生素抗性基因）的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。
目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因，其中最常见的是共转化法(Komari 1996，McCormac 等2001)。
共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择标记基因，另一套表达盒含有目的基因，它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。
转基因植株在减数分裂过程中，标记基因和目的基因发生分离，从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。
共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记，是保证人畜和环境安全的重要措施，因此受到了广泛的重视。
Zhou 等（2003）认为，用分别含一个T-DNA区的两个载体共转化的效率低于双T-DNA区表达载体的共转化效率。
目前关于利用双T-DNA区表达载体，获得无选择标记转基因阳性株系的研究已有不少报道（唐俐等2006，张秀春等2006，于恒秀等2005）。
花药培养与遗传转化技术相结合，可以快速获得纯合转基因植株（斯华敏等，1999，付亚萍等，2001），但是应用花药培养快速获得只含目的基因而无选择标记的转基因研究尚未见报告。
水稻是最主要的粮食作物，转基因水稻的安全显得尤为重要。
本实验室通过农杆菌介导的水稻转化体系，将包含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻，由于该表达载体采用双T-DNA结构，将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。
在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株，得率为9.87％。
遗传转化技术遗传转化技术是一种将外源基因导入植物细胞并使其在整个植物体中传播的技术。
它是现代分子生物学和植物育种中的重要工具，被广泛应用于提高农作物产量和质量，增加抗病虫害能力，提高耐逆性以及改良植物形态和生理性状等方面。
遗传转化技术的基本步骤包括基因导入、基因表达和基因传递三个环节。
首先，通过载体介导，外源基因被导入植物细胞。
载体可以是嵌入外源基因的质粒或病毒。
质粒常用的载体是农杆菌（Agrobacterium tumefaciens），它能够通过致病基因导入植物细胞的方式实现基因转移。
而病毒则通过直接注入带有外源基因的RNA或DNA来实现基因导入。
接着，外源基因在植物细胞中被表达并转录成RNA，然后翻译成蛋白质。
最后，通过细胞分裂和花粉传输等方式，外源基因被传递到下一代植物体中。
遗传转化技术可以应用于大多数植物物种，但不同物种之间的表达效果可能有所不同。
对于不易被转化的植物物种，可使用基因枪或电穿孔等方法来提高转化效率。
此外，还可以利用基因编辑技术如CRISPR-Cas9来精确修改植物基因组，实现对目标基因的精确编辑。
遗传转化技术在农业领域有着广泛的应用。
通过导入外源基因，可以使植物具备抗虫、抗病的能力，减少农药的使用。
例如，转基因玉米中的Bt基因可以抑制玉米螟的生长，从而减少农民对杀虫剂的依赖。
此外，遗传转化技术还可以提高植物的营养价值，使作物更加营养丰富。
例如，转基因水稻中的金属螯合蛋白基因能够有效吸收土壤中的重金属，从而减少重金属对人体的危害。
不仅在农业领域，遗传转化技术也在植物学研究方面发挥着重要作用。
通过改变植物的方式、形态和生理性状，科学家可以深入研究植物的生长发育、代谢途径以及抗逆机制。
例如，通过转基因方式使水稻产生异色花朵，有助于对花色形成的相关基因进行研究。
此外，遗传转化技术还可以应用于植物品种改良，加速育种进程。
通过导入耐盐、耐旱等逆境相关基因，可以培育出具有更好逆境耐受性的新品种。
本实验室用的水稻遗传转化程序1．愈伤组织的诱导：去壳的水稻种子，经70%乙醇浸润30秒后，灭菌水洗涤1次，然后用1%次氯酸钠溶液消毒20min,灭菌蒸馏水洗涤4次，无菌滤纸吸干多余水分后，将种子置于愈伤组织诱导培养基上，28 ℃黑暗下培养。
经常检查污染情况，3-4周后诱导愈伤出现。
诱导培养基配方如下:大量N6B5 微量B5 有机B5 铁盐脯氨酸 2g/L水解酪蛋白 300mg/L2,4-D 2.5 g/L蔗糖 30 g/L2．愈伤组织的继代：当胚性愈伤组织从种子盾片处生长出来后，选择颜色鲜黄，质地致密的直径1-2mm的球型愈伤组织，置于愈伤组织培养基2上，28℃、黑暗下继代培养，每4周继代一次(NB培养基)；不要用继代5次以上的材料做转化材料2,4-D和L-脯氨酸的浓度分别调整为2mg/L和0.5g/L)继代培养基配方如下大量N6B5 微量B5 有机B5 铁盐水解酪蛋白 300 mg/L脯氨酸0.5 g/L2,4-D 2 g/L蔗糖 30 g/L3．农杆菌的转化：(1)取生长健壮的愈伤组织转入新的NB培养皿中（25-30个/皿）(2)第3天，将经活化的农杆菌于液体培养基中，28˚C、200r/min培养至OD600=0.6左右，离心收集细菌重悬于等体积的NB培养基中，加入终浓度为100umo1/L的乙酰丁香酮，作为侵染液。
(3)收集生长旺盛、状态良好的直径2-3mm的愈伤组织，放于上述侵染液中，l00r/min振荡培养20min，静置10min后取出愈伤组织，无菌滤纸吸去多余菌液，(4)选取生长良好的胚性愈伤组织然后置共培养培养基共培养的培养基:N大量6B5 微量B5 有机B5 铁盐水解酪蛋白 300 mg/L脯氨酸500 m g/L2,4-D 2 g/L蔗糖 30 g/L2Omg/L 乙酰丁香酮，pH5.2。
4．抗性筛选：共培养后，用无菌滤纸吸干多余水分后，将愈伤组织转移到选择培养基上，28、黑暗下选择培养，培养时间3-4周。
,. 水稻遗传转化体系Protocol
Introduction 1．水稻的遗传转化研究历史与现状 20 世纪80 年代末, 水稻的遗传转化首获成功。1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源基因导入到水稻中并获得再生植株[1~3]。1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中获得成功[4], 随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。 此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。虽然Hiei 等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5~13 个独立的转化植株)。 2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11] a. 转基因抗虫水稻 对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技,. 术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。 b. 转基因抗病水稻 见抗水稻病毒研究 c. 转基因抗旱水稻 d. 转基因营养高效利用水稻 e. 转基因优质水稻 f. 转基因高产水稻 g. 转基因抗除草剂水稻 3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用 随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒基因工程上的广泛研究和应用[13~18 ]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。目前，国内在这方面属于起步阶段，仅仅做了一些构建干扰载体和获得RNA干扰植株[19~27]，但并没有获得高抗植株，国外，特别是日本在这方面有着较大优势，Omura T实验室分别在2009年和2010已获得了对RDV、RSV高抗植株[28，29]，另外Himani在2007年也获得了对RTBV高抗的植株[30]。（重要是看以上文献，一定要认真体会）
Materials and methods 一、接种 ,. 步骤： 1、 保存在-20度的种子使用前取出（用多少取多少，用纸包好），置于37度恒温箱烘烤10-20小时左右（最好过夜）。 2、 拨去种皮（1），尽量不要损害到种胚，拨皮后检查，将胚乳表面发黑或胚死亡的种子剔掉（2），用纸包好带入组培操作间。 3、 （以下操作均在超净工作台内进行）将种子倒入干净的100ml三角瓶中，加入75%乙醇消毒2分钟，期间要不断的摇动，倒出酒精，再加入20ml 2%的NaClO(3),覆盖种子即可，室温在摇床上160rpm摇25min，将NaClO倒掉，将种子用无菌镊子转移至高压灭菌过的滤纸上，在超净工作台上吹干为止，然后将种子接入诱导培养基（NB培养基）（5）上，每皿20粒（4），注明日期，封口膜封口，置于27℃恒温箱中暗培养（15）； 二、掐芽 种子在培养箱中培养7天后，长出可见的芽和遁片，根据种子的生长状态，将芽掐掉（16），继续在27°C恒温箱中暗培养。 三、继代 掐芽后7天左右，进行第一次继代，用镊子将新长出的愈伤夹成小块（17），转入新的NB培养基中，每皿20粒，在27度恒温箱中暗培养15天后进行第二次继代，培养15天后，就可以长出颜色鲜黄，表面光滑，直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒。大小合适的愈伤可以进行预培养，小的就进行第三次继代。 四、农杆菌介导的水稻遗传转化 共培养（整个操作过程需8天） 第一天：选取自然分散，颜色鲜黄，直径约为2-3mm的颗粒愈伤，置于,. 27度暗培养4天。 第三天：农杆菌划线28°培养，两天后农杆菌长满即可洗脱（18），用于转化。 第五天：悬浮农杆菌，悬浮于添加有100uM乙酰丁香酮（AS）(19)20ML的AMM液体培养基(20)中，剧烈震荡1min后，静置1h，让农杆菌形成悬浮液，取菌液于三角瓶中加入经预培养的愈伤，略微摇动静置30min，于无菌纸上晾干愈伤后置于添加有100uM的乙酰丁香酮的NB培养基（AS培养基（21）上27度暗培养3天。 第八天：等农杆菌生长至可见的愈伤下的菌斑，但未长满愈伤时，挑取愈伤于无菌培养瓶中，用无菌水冲洗，直至无可见菌丝为止，最后用含300mg/l的羧苄无菌水静置1h，置于无均滤纸上晾干后，转移至筛选培养基上。 五、抗性愈伤的继代筛选 当抗性愈伤在朝霉素30培养基（22）上生长15天后（23），将愈伤换到新的朝霉素30培养基上，15天后可观察到一些褐化愈伤开始长出的新的愈伤，继续培养，等新愈伤长出很多时转移至朝霉素50培养基（24）上，筛选3-7天。 六、分化 从朝霉素50培养基中将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基（25）上再生，成团而不是分散放置（26），一周后愈伤开始转绿，三周后开始长出幼芽，随后根也长出，当芽长至2-3cm时，就可移至1/2MS培养基（生根培养基）上（27）。 分化间进行，25°（28），光14小时，暗10小时。 七、生根 ,. 超净工作台内进行，每个培养瓶中只放一个抗性愈伤诱导出来的苗（29），在生根培养基上生长10天。（30）分化间进行，25°，光14小时，暗10小时。 八、炼苗 生根十天后开盖，加已晾两天或晒过的水，泡过培养基即可（28），2天后（28）用水洗掉生根培养基，加晾两天或晒过的水浸过根，3-7天后待生长状态好了后移栽大田。（期间每天要加水，确保根都泡在水中）。分化间进行，25°，光14小时，暗10小时。 九、移栽大田 土、水提前晒上两天，移栽盆装4/5体积的土，用水浸透即可，不能太多水，刚好浸过土面最好。 移栽：在盆上标记好，盆宽移栽两株，长四株；移栽时不能插深，植株能站住即可。 10天后可以施一点肥，不能太多。20天后可以每10天施肥一次，同样不能太多，太多会烧苗（如烧苗，施肥3天后可以观察到，应马上将水换掉）。 要保证白天29°（30），晚上23°；光14小时，暗10小时。（31）
Notes (1) 不用一粒一粒用手拨皮，在桌上垫一些白纸，用书压。力道要掌握好，太用力把种子压碎了，用力不够只能去个别的种皮，效率低。 注意：接触种子的纸必须是全白色的，不能有印刷有子的，否则用力压时，墨就着黑色上种子。 ,. (2) 不正常的种子，一律丢弃。因为后期若是一粒种子长菌的话就污染了整盘。 (3) a. 20ml 2%的NaClO的配制： 实验室买的是有效浓9%的NaClO，所以取4.5ml 9%的NaClO加16ml蒸馏水即配成2%的NaClO b. 2%的NaClO现用现配，因为NaClO见光分解，所以配了就要赶紧用。 (4) 20粒共三圈，外圈12粒，中圈7粒，里一粒。 (5) NB培养基的配置（800ml）： 实验准备：所有玻璃仪器必须洗净再用双蒸水润洗 步骤：取一升三角瓶 → 加24g蔗糖 ↓ 依次加入80ml N6max（10×） (6) 16 ml 铁盐 （50×） (7) 8 ml 肌醇 （100×） (8) 4 ml B5miin（200×） (9) ↓ 加多点（勿超500）三蒸水摇使其溶解，倒入1升量筒中，再加三蒸水定容至780ml ↓此时PH应为4.2-4.3 PH调至5.8（用pH计，KOH调） ↓ 加2.1g植物凝胶 （10） ↓ ,. 高压灭菌（121°20min） ↓ 灭完前30min，拿出16ml有机，化为液态 加1.6ml2.4-D（1mg／ml）(11)至16ml有机(12)中 ↓ 待培养基稍烫手抽滤（13），倒培养基(14) (6) N6max（10×）的配制（配1L）： ① KNO3 28.3 g ② KH2PO4 4.0 g ③（NH4）2SO4 4.63 g ④ MgSO4·7H2O 1.85 g ⑤ Cacl2·2H2O 1.66 g 或Cacl2 1.25 g 注： a．①②③④一起溶解混匀成A， b．⑤单独溶解，再与A交替混匀，以免长期存放产生沉淀； c．4℃冰箱保存；
(7) 铁盐（50×）的配制（配500mL）： ① FeSO4·7H2O 0.695g g ② NA2EDTA ·2H2O 0.9325 g 注： a．①②分别溶解，再交替混匀，边加边摇匀； ,. b．棕色瓶装； c．4℃冰箱保存；
(8) 肌醇 （100×）的配制（配1L）： 10 g肌醇（Inositol）用双蒸水定容至1L； 4℃冰箱保存； (9) B5miin（200×）的配制（配500mL）： ① MnSO4.H2O 0.758 g ② H3BO3 0.3 g ③ ZnSO4·7H2O 0.2 g ④ CuSO4·5H2O 0.0025 g ⑤ CoCl2·6H2O 0.0025 g ⑥ KI 0.075 g ⑦ NaMoO4·2H2O 0.025 g 注： a．一起溶解，三蒸水定容至500mL； b．棕色瓶装； c．4℃冰箱保存；
(10) 非琼脂粉。 (11) 2,4-D（1mg/ml）配1100ml）： 加1ml无水乙醇用枪吸吹，可溶解。再用纯水定容至100ml； 4℃冰箱保存；
