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四种外植体遗传转化体系的探究

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植物基因转化常用方法(植物遗传,农杆菌、病毒介导和基因枪转化法)

植物基因转化常用方法(植物遗传,农杆菌、病毒介导和基因枪转化法)

一. 植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。

另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。

二.农杆菌介导的基因转化方法（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。

它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。

其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。

农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。

T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。

第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。

1. Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。

Ti质粒大约在160～240kB之间。

其中T-DNA大约在15kb-30kb。

Vir基因区在36kb 左右。

除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。

T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。

植物遗传转化研究进展

植物遗传转化研究进展

植物遗传转化研究进展一、植物遗传转化技术的发展目前，基因枪法是最常用的植物遗传转化技术之一、该方法通过将特定基因或外源DNA片段载入微粒或金属微粒表面，并利用高能量加速器，将其“枪射”入植物细胞中。

这种方法具有转化效率高、转基因植物种类广等优点。

另一个常用的植物遗传转化技术是农杆菌介导的转化法。

该方法通过注射农杆菌悬浮液进入植物受体细胞中，利用特定的农杆菌转移DNA到植物基因组中。

农杆菌介导的转化法具有转化效率高、适用范围广的特点。

二、植物遗传转化应用领域在农业领域，植物遗传转化技术可以用于改良作物的抗性能力，提高作物产量和品质，并改善作物的耐盐碱、耐旱、抗虫等性状。

例如，通过转入抗虫基因，可以使作物具备抵抗虫害的能力，从而减少农药的使用，达到生态环境保护的目的。

同时，植物遗传转化技术也可以用于改良作物的适应能力，使其能够在恶劣环境下存活和生长。

在医药领域，植物遗传转化技术可以用于生产重要药物和疫苗。

通过将相关基因导入植物中，利用植物生长发育的能力，可以大量生产特定蛋白质，从而制取药物和疫苗。

这种方法不仅生产成本低，还减少了对动物的依赖，有利于提高疫苗的安全性。

在环境领域，植物遗传转化技术可以用于修复受到污染的土壤和水体。

通过将相关基因导入植物中，使其能够吸收和转化毒性物质，从而达到治理污染的目的。

这种方法被广泛应用于石油污染地区、重金属污染地区等。

三、植物遗传转化的研究进展随着植物遗传转化技术的发展，人们不断探索新的方法和途径，以提高转化效率和稳定性。

此外，人们也在探索非转基因的植物遗传改良方法。

在非转基因改良中，人们通过引入RNA干扰技术、微量RNA技术等方法，通过调控内源基因的表达来改变植物的性状。

这种方法避免了外源基因的导入，从而减少了对转基因植物的争议。

总的来说，植物遗传转化技术在农业、医药和环境等领域有着广泛的应用和研究。

随着科学技术的不断进步，植物遗传转化技术将为人类创造更多的可能性和机会。

植物遗传转化

植物遗传转化

花椰菜遗传转化方法如图： 发根农杆菌介导 根瘤农杆菌介导
（三）林木遗传转化的技术
目前以掌握了杨树、白桦、桉树、落叶松、核 桃、苹果、沙田柚等树种外源基因转化技术。主要 转化方式是农杆菌介导法。增强植物抗病、耐高温、 耐旱等方面。
（四）药用植物遗传转化的技术
主要采用农杆菌介导法，其他方法成功的例子 极少。
第十七章：植物遗传转化
Section 1: 植物遗传转化的方法
Section 2: 转化植株的检测 Section 3: 几种植株遗传转化的 技术
植物遗传转化 （plan genetic transformation): 应用重组DNA技术、细胞组织培养 技术或种质 系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA片 段插入到受体植物基因组中并通过减数分裂获 得新植株的技术。
•
（2）方法：人们将目的基因插入到经过 改造的T—DNA区，借助农杆菌的感染实现外 源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过 细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中， 近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物 (尤其是水稻)中也得到了广泛应用。
（3）转化步骤可简单概括为以下方面：
Section 2: 转化植株的检测
以报告基因检测为例：
报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶
的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被 鉴定的基因。目前主要的报告基因如下：
Section 3: 几种植株遗传转化的技术
（一）大田作物遗传转化的技术
①油菜的遗传转化技术 农杆菌介导转化法：根据不同的基因型选择适的培养基。
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大 多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重 组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/ 分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定 （这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见 第五步） 几种方法进行检验（根据要求选取不同方 法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物 体进行个体生物学水平鉴定。

[医学]第十一章植物的遗传转化技术

[医学]第十一章植物的遗传转化技术

二、植物遗传转化方法
1.农杆菌介导法 农杆菌是一类革兰氏阴性土壤杆菌（G－），活在植物
根的表面依靠由根组织渗透出来的营养物质（冠瘿碱）生 存的一类细菌。
农杆菌可分为根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciems （含Ti质粒）和发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes （含 Ri质粒） ，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导 的遗传转化最多。
二、植物遗传转化方法
1.农杆菌介导法 Ti质粒的改造 除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因， 因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物； 除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成 大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长； 除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度； 安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作； 安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子 和polyA化信号序列； 安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。
一、植物遗传转化的受体系统
二、植物遗传转化方法
转基因方法 概括起来说主要有两类： 第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移 系统法。如农杆菌介导法、病毒介导法。 第二类是外源目的DNA的直接导入。如基因枪法、电 激法、超声波法、显微注射法、花粉管通道法等。
二、植物遗传转化方法
载体介导转移系统 最常见的转基因方法。 将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携 带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核 染色体复制和表达。 农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒 (root-indcing plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应 用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。

小麦不同品种外植体的农杆菌转化方法的研究

小麦不同品种外植体的农杆菌转化方法的研究

农业生物技术学报!"#$%&’(")(*+$,-#’.#$&’(/,".0-1%"’"+2((((34435647(869:((((3;<3=!本项目由国家自然科学基金资助，编号为>?@4444A 77付永彩:女，6?BA 年生，博士后，副研究员5现在中国农业大学植物遗传育种系工作收稿日期：3446C4;C3A·研究报告·小麦不同品种外植体的农杆菌转化方法的研究!付永彩吴茂森成卓敏"中国农科院植物保护研究所，北京#$$$%&’本实验在小麦中对农杆菌介导的大麦黄矮病病毒()基因进行了转化。

选择生产用小麦品种（系），对影响小麦组织培养条件和转化的主要因素进行研究，并获得了小麦转基因植株。

研究表明，增加肌醇浓度有利于小麦愈伤组织的分化；而添加D/D 却只对部分品种有效；采用幼胚和幼胚愈伤组织均能获得转基因植株；以茎尖和花药愈伤组织为受体未能获得阳性植株；小麦不同品种对不同农杆菌菌株的反应不同。

小麦；农杆菌；转化E10&.7D+$"F&-.0$,#G CG0H,&.0H7I$&%J)"$G&.,"%7K,.177L,))0$0%.7M&$,0.27NOP’&%.J(Q#(R"%+-&,((((E#(S&"J0%((((T10%+(U1#"G,%8V%J.,.#.0(")(W’&%.(W$".0-.,"%5(T1,%0J0(D-&H0G2(")(D+$,-#’.#$&’(X-,0%-05(/0,Y,%+(6444?A9/2(.10(D+$"F&-.0$,#G CG0H,&.0H(G0.1"H5F&$’02(20’’"K(HK&$)(Z,$#J （/RLM ）TW(+0%0(K&J(.$&%J)"$G0H(,%."(K10&.(Z&$,C0.,0J5(K1,-1(K0$0(,GP"$.&%.(,%(&+$,-#’.#$&’(P$"H#-.,"%[I10(,GP"$.&%.(()&-."$J(,%)’#0%-,%+(.$&%J)"$G&.,"%(,%-’#H,%+(.,JJ#0C-#’.#$0H(-"%C H,.,"%5H,))0$0%.(Z&$,0.2(0OP’&%.J(&%H(D+$"F&-.0$,#G(J.$&,%J(K0$0(J.#H,0H[E10&.(.$&%J+0%,-(P’&%.J(K0$0(&-\#,$0H[K10&.^7D+$"F&-.0$,#G CG0H,&.0H^7.$&%J)"$G&.,"%77自#%%*年(+,-等.#/利用农杆菌转化水稻获得转基因植株以来，农杆菌介导的转化法在禾本科作物上的研究迅速展开。

植物组织培养：第十三章 植物遗传转化

植物组织培养：第十三章 植物遗传转化
• 在农杆菌侵染外植体前进行预培 养可以减轻伤害胁迫，调整细胞状 态。
• 接种时所用菌液浓度和侵染时间 是影响转基因植株再生的关键因素 之一。
• 共培养：接种菌体后的外植体培养 在诱导愈伤组织或不定芽固体培养基 上，在外植体细胞分裂、生长的同时， 农杆菌在外植体切口面也增殖生长， 两者共同培养的过程称为～。
• Horsch等(1985)首创叶盘法，用根 癌农杆菌感染烟草叶片外植体，获得 了转基因烟草。
（一）生物学特性与转 化原理
1.生物学特性
• 根癌农杆菌将Ti质粒的DNA片 段、发根农杆菌将Ri质粒的DNA 片段导入植物细胞的基因组中，导 致植物发生冠瘿瘤和毛状根。
• 根据携带不同Ti质粒的根癌农杆 菌诱导的冠瘿瘤所产生的冠瘿碱类 型，将根癌农杆菌分为章鱼碱型、 胭脂碱型和农杆碱型三种根癌农杆 菌。
一、农杆菌介导法
• Ackermann(1977)，Wullems等 (1981)，De Greve等(1982)和Spano 等(1982)首先在烟草和马铃薯中由Ri质 粒和Ti质粒转化的细胞再生出植株。
• Zambryski等(1983)和De Block等 (1984)以及Horsch等(1985)分别报道 了用切去癌基因的根癌农杆菌和发根 农杆菌进行遗传转化，获得了形态正 常的转基因植物。
第十三章 植物遗传转化
• 植物遗传转化（plant genetic transformation）：是指将外源基因 转移到植物体内并稳定地整合表达与 遗传的过程。
• 农杆菌介导法、基因枪法、植株原 位真空渗入法、电击法、聚已二醇法、 花粉管通道法、显微注射法、激光微 束法、超声波法、生殖细胞浸泡法、 脂质体法
（5） Vir区基因的活化
• 大多数双子叶植物受伤后，植物 细胞会分泌某些酚类化合物，这些 酚类化合物可诱导Vir区基因活化， 使农杆菌转化成为可能。

棉花遗传转化过程中外植体对卡那霉素敏感性的研究

一
图２ 胚性 愈伤 组织 （ Ｃ Ｅ ）对卡 那霉 素 （ ａ ）的敏感 性 Ｋｎ
Ｆｉ ２ ＳｅｎＳｉ ｌｉ ｏｆ ｅ ｇ． ｂｉ ｔＹ ｍｂｒｙ ｏｇｅｎｉ Ｃａｌｌ ｔ ｔｈ Ｃ ｕｓ ｏ ｅ
ｃ ｎｃ ｎｔ ａｔ ｏ ｏ ｎａ ｙ ｎ （ ａ ｏ ｅ ｒ ｉ ｎ ｆ Ｋａ ｍ ｃｉ Ｋ ｎ）
１材 料 和 方 法 １１材 料 ． 棉花 品种 为 “ 字棉 ３ ２ 珂 １ ”， 由上 海 交通 大学 农业 与 生物 学 院 左 开井 博 士提 供 。 １ ２主 要培 养基 如 下 ． Ｇ 培 养基 ：Ｍ ＋ 萄糖 （ ％ 结 冷胶 （ｅ ｌ ｎ Ｇ ｍ （ ． ％ ｌ Ｓ葡 ３ ）＋ Ｇ ｌ ａ ｕ ） ０ ３ ）＋ Ｉ Ａ Ｔ ， 一 各０ １ ｇ Ｌ ＋ Ａ 、Ｋ 、２ ４ Ｄ ． ｍ ／ 羧苄 青 霉素 （ａ ） ５ ０ ｇ Ｌ 卡那 霉素 Ｃｂ ０ ｍ ／＋
佳。 １ ３方 法 ． ． Ｅ ）对卡 那霉 素 （ａ）的敏 感 性变 化 曲线 ｋｎ 棉花 下 胚 轴 、胚 性 愈伤 组 织 （ Ｃ Ｅ ）、体 细 胞 胚 胎 （ 状 体 ） 胚 ２ ２胚 性愈 伤组 织 （ｃ 获 得 的具 体方 法 参照 商海 红 （ ０ ９ ２ ０ ）和 Ｇ ｎ ｓ ｎ Ｓ ｎ ｌ ｕ ａ ａ ｄ ａ ｅ ａ ｕ ｉｋ ｍ ｒ ｎ
（ａ ） Ｈ ６ ３ ６ ５； Ｋ ｎ ，Ｐ ＝ ． － ．
图１棉 花下 胚 轴对 卡那 霉 素 （ ａ ）的敏 感性 Ｋｎ
Ｆｉ １ ｅ ｉ ｌ ｔｙ ｇ． Ｓ ｎｓ ｂｉ ｉ ｏｆ ｘ ａ ｓ ｏ ｈｅ ｅ ｐｌ ｎｔ ｔ ｔ ｃｏ
在 根 癌农 杆 菌介 导 的棉花 遗传 转化 中 作 为筛 选抗 生素 ，理 论 上认 为 ，卡那 霉素 （ ａ ）浓度 越 高 ，越 能抑 制外植 体 的生长 ， Ｋｎ 便 越有 利 于最 终筛 选 出所 需 要 的阳性 转基 因植株 ，而 且 也可 以在 很 大程 度上 减 少遗 传 转化 后期 筛 选 阳性转 基 因植 株 的工作 量 。但 是 卡那霉 素 （ａ ）浓度 过 高反而 不利 于棉花 外植 体再生 成苗 ，因 Ｋｎ 此 ， 以下 胚轴 作为遗 传转 化 的外植 体材 料时 ，卡那 霉素 （ａ ）的 Ｋｎ 筛选 浓 度应 选择 ５ 或 ７ ｍ ／ 为最 佳 。这 与李燕 娥等 （ ０ ０ ０ ５ｇ Ｌ ２ ０ ）所 建 立 的棉花 农杆菌 介 导高效 转化 体系 中所 使用 的卡那霉 素 （ ａ ）筛 Ｋｎ 选浓 度７ ｇ Ｌ ｈ 吻合 ，而李俊 兰 等 （ ０ ２ ０ ｍ ／ Ｌ较 ２ ０ ）在研 究 中则提 出了 采用 ２ 或５ ｍ ／ 作 为 筛选 浓度 ；以胚 性愈 伤组 织作 为遗 传转 化 的 ５ ０ｇＬ 外植 体材 料 时 ，卡那霉 素 （ ａ ）的筛选浓 度应选 择 １ ０ ｍ ／ ；胚 Ｋｎ ０ ｇ Ｌ 状 体对 卡那 霉素 （ａ ）的浓度 变化 极为敏 感 ，在诱导 其生长 的培 Ｋｎ 养 基 中最 好 加入低 浓度 的Ｋ ｎ ａ ，应 选择 １—０ ｇＬ ａ 为最佳 。这 ０２ｍ ／ 的Ｋｎ 样 既 能保 证在 晟 大程 度上 筛选 出阳性 转基 因植株 ，又 能避 免 高浓

植物遗传转化体系的建立


8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
学习后的感受：
1.植物遗传转化受体？
2.植物遗传转化方法？ 3.转基因植株的再生？
4.转基因植株的检测？
8 植物遗传转化体系的建立 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体
所谓基因转化受体是指用于转化的外植体通过组织培养途径
8 植物遗传转化体系的建立 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation）
根 癌 农杆 菌 (Agrobacterium tumefacience) 介 导 法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。其Ti质 粒 (Tumor-inducing plasmid) 具有将 DNA 整合到植物 染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。
8 植物遗传转化体系的建立 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
8 植物遗传转化体系的建立 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation） 8.2.1.2 Ti质粒的构建
8.2 植物基因转化的方法 8.2.1 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated transformation） 8.2.1.2 Ti质粒的构建
（ 3 ）在去除的 T-DNA 区，增加至少一个可以在植物体内表达的 选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。 （4）在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。 （5）在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细 菌中表达，而不能在植物中表达。

农杆菌介导大豆不同外植体遗传转化研究

农杆菌介导大豆不同外植体遗传转化研究刘翠;李喜焕;常文锁;张春锋;张彩英【摘要】In this study, the MYB transcription factor GmPHRl was transformed into three soybean genotypes by Agrobacterium -mediated different explants. The results showed that the shoot tip transformation system was with the highest shoot induction, shoot regeneration, transformation ratios and little genotype dependence. But it was the least sensitive to antibiotics, so there were some escapes in this system. The transformation system with embryonic tip was higher in shoot induction, shoot regeneration and transformation ratios. In addition, it was more sensitive than others to antibiotics, so embryonic tip transformation was a more ideal soybean genetic transformation system. The cotyledonary node transformation and the hypocotyl transformation systems were lower in shoot induction, shoot regeneration and transformation ratios and significant differences among genotypes existed. By using the above transformation systems T,transgenic lines of the three soybeans were obtained.%以MYB转录因子GmPHR1为目的基因,冀豆12、冀豆16和绥农14为转化受体,比较农杆菌介导大豆不同外植体的遗传转化技术,为大豆转基因育种提供技术支撑.结果表明,以茎尖转化系统的不定芽诱导率、植株再生率和转化效率最高,且对基因型的依赖性最小,但由于对抗生素的敏感性较差,因而存在一定程度的假阳性；其次,以胚尖转化系统的不定芽诱导率、植株再生率和转化效率较高,对基因型的依赖性较小,同时对抗生素的敏感性较强,因而是一种较为理想的转化系统.而子叶节、下胚轴转化系统则表现出不定芽诱导率、植株再生率和转化效率均较低,且存在较强的基因型依赖性等不足.同时,利用上述4种转化系统,获得了3个供试大豆品种的转基因T,植株.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2012(027)003【总页数】6页(P35-40)【关键词】大豆;农杆菌介导转化;外植体类型;转基因【作者】刘翠;李喜焕;常文锁;张春锋;张彩英【作者单位】教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室,河北农业大学,河北保定071001;教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室,河北农业大学,河北保定071001;教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室,河北农业大学,河北保定071001;河北省农林科学院,河北石家庄050051;教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室,河北农业大学,河北保定071001【正文语种】中文【中图分类】S565.1转基因技术可以实现基因定向改造和重组转移,打破物种界限,因而在提高植物抗性、改良作物品质等方面具有广泛应用[1-2]。

园艺植物遗传转化


第二节 园艺植物遗传转化方法
1、转化原理
（1）特性：PEG是一种水溶性的细胞融合剂和渗透剂，相对 分子质量为1500—6000，pH4.6—4.8，因聚合程度不同而异。 （2）转化原理：PEG不仅可以使细胞膜之间或使DNA与膜形成 分子桥，促成相互间的接触和粘连，而且可以改变细胞膜的 表面电荷，干扰细胞间的作用，从而改变细胞膜的通透性， 诱导原生质体摄取外源基因DNA。
园艺植物遗传转化
第二节 园艺植物遗传转化方法
3、优缺点 基因枪转化法具有下列优点： 1）无宿主限制，特别适宜那些由原生质体再生植株较为困难和 对农杆菌感染不敏感的单子叶植物，提高了单子叶植物的转化 效率； 2）操作简单，可控程度高，可以根据实验的需要调控微弹的速 度和摄入浓度，命中特定层次的细胞，提高遗传转化效率； 3）靶受体类型广泛不受基因型的限制，能转化所有具有分省潜 力的植物的任何组织或细胞，包括原生质体、根、叶以及种子 的胚、子叶、分生组织、愈伤组织、花粉、子房等；
Fromm等首次使用该法成功将氯霉素乙酰转移酶cat
基因导入玉米原生质体。 电穿孔转化法可用于原生质体的瞬时和稳定
转化，也可用于带壁的植物细胞的遗传转化。
园艺植物遗传转化
第二节 园艺植物遗传转化方法
1、转化原理
1）原理：利用高压电脉冲作用，在植物细胞膜或原生质体上 造成非对称穿孔，形成瞬间通道，这种通道孔径在8.4mm左右， 每个细胞膜上有上百个，因此能允许外源基因的进入；
园艺植物遗传转化
第一节 园艺植物遗传转化受体系统
(3)稳定的外植体来源
遗传转化的频率低，需要反复的实验，所以要建立一 个高产的组织培养再生系统并能用于遗传转化，需要大量 的、稳定的外植体作为材料。
转化的外植体一般采用无菌实生苗的子叶、胚轴、幼 叶等，或采用可进行快速繁殖的材料
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评价指标：
▫ 不定芽诱导率、不定芽长
研究内容
不同外植体除草剂筛选浓度的探究 大豆胚尖遗传转化体系的优化 生长点非离体微创转化体系的探究 大豆四种外植体遗传转化体系的探究
胚尖遗传转化体系优化
基因型：黑农37、合丰35 优化条件
超声波辅助转化
时间：0、2、4、6、8、10min
预培养时间
农杆菌介导的不同大豆外植体遗 传转化体系的研究
导 学 师：王 罡教授 生：钟 影
时间：2012年11月15日
• 1 研究背景及目的意义
• 2 研究内容
• 3 技术路线
• 4 目前工作进展
• 5 实验进度及安排
研究背景
• 大豆[Glycine max( L.) Merrill］是世界上最重要 的油料作物和高蛋白粮食作物之一，也是人类植 物性蛋白和油脂的重要来源并在维持地球生物圈 氮循环具有重要的作用。 • 草甘膦（Glyphosate），学名N-(膦酰基甲基)氨 基乙酸，只有极少数的杂草对它具有抗性，成为 世界上生产使用量最大的除草剂品种。草甘膦作 用机理是抑制植物体中5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽 草酸合成酶（EPSPS）的活性，使植物体芳香族 氨基酸合成受阻，致使植物死亡。
研究内容
不同外植体除草剂筛选浓度的探究 大豆胚尖遗传转化体系的优化 生长点非离体微创转化体系的探究 大豆四种外植体遗传转化体系的探究
除草剂筛选浓度探究
基因型：黑农37、合丰35 外植体：子叶节、胚尖、下胚轴 预期浓度梯度：
▫ 胚 尖：0、2.5、5、7.5、10、12.5mg/L ▫ 子叶节：0、3、6、9、12、15、20mg/L ▫ 下胚轴：0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mg/L
梯度：0、1、2、3d
抗氧化剂
DTT、硫代硫酸钠、L-cys、硝酸银
评价指标
不定芽诱导率、基因转化效率、褐化率
研究内容
不同外植体除草剂筛选浓度的探究 大豆胚尖遗传转化体系的优化 生长点非离体微创转化体系的探究 大豆四种外植体遗传转化体系的探究
生长点非离体微创转化体系的探究
• 基因型：黑农37、合丰35 • 探究因素：
较大突破。
目的意义
• 本研究旨在对国内常用的几种大豆外植体遗传转
化体系进行系统研究，通过研究在农杆菌介导下，
不同类型外植体在不定芽诱导率、植株再生率、 除草剂敏感性及基因转化效率等方面的差异，以 期获得抗除草剂大豆转基因植株并建立一种相对 稳定、高效的的大豆转化体系，为进一步研究改
进提供参考，为大豆的转基因育种提供技术支撑。
外植体制备
侵染
收集菌体制备重悬液
共培养
筛选、培养
分子鉴定
子叶节转化过程
胚尖转化过程
下胚轴转化流程
生长点非离体微创转化体系的研究
种子萌发
共培养
光照预培养
植入蛭石
目前工作进展

黑农37（已经完成）
从上到下，从左至右，草甘膦浓度依次为：0、2.5、5、7.5、10、12.5mg/L
胚尖遗传体系优化及转化（进入检测阶段）
• 农杆菌介导的大豆遗传转化是国内外应用最为成
熟、操作简便的转化方法。至今，研究者们已经
利用大豆子叶节、成熟胚、胚尖、下胚轴、未成
熟子叶、初生叶、花絮等获得了转基因大豆再生 植株，但不同外植体的转化效率各不相同。其中，
尤以子叶节、胚尖两种外植体研究较为深入，子
叶节的遗传转化体系最为成熟，但转化效率没有
▫ 成熟胚培养时间
2、3、4、5d(根据胚轴伸长情况而定)
▫ 重悬液种类
无菌水、1/2MS盐、1/10MS盐、MS盐
▫ 转化位点
植株每个位节做PCR检测，为T1代检测做基础
• 评价标准
▫ 转化率、再生率
研究内容
不同外植体除草剂筛选浓度的探究 大豆胚尖遗传转化体系的优化 生长点非离体微创转化体系的探究 大豆四种外植体遗传转化体系的探究
成苗
生根
微创法（等待T0代种子，T1代检测）
现阶段
实验进度及安排
• 2012-03～2012-05 试验材料准备及农杆菌验证
• 2012-06 ～2012-08 除草剂浓度梯度筛选
• 2012-09 ～2012-11 黑农37四种外植体的转化及 微创法实验 • 2012-12～2013-04 基因型合丰35四种外植体的 转化及T0代播种
四种外植体遗传转化体系的探究
• 载体：带有 EPSPS、Bar基因的PSOY20载体 • 基因型
• 黑农37、合丰35
• 外植体 • 子叶节、胚尖、下胚轴、半种子 • 评价标准 • 不定芽诱导率、植株再生率、除草剂敏感性及
基因遗传转化效率
总体技术路线
挑选大豆 氯气消毒 挑取农杆菌单菌落接种于YEP中，28℃ 摇床过夜培养 1:10扩大培养，至OD600=0.5~0.6左右
实验进度及安排
• 2013-05～2013-08 胚尖遗传转化体系的优化及
T1代检测
• 2013-09～2013-12 整理实验数据，补充实验 • 2014-01～2014-03 开始论文撰写工作 • 2014-04～2014-05 种植种子，进行分子检测 • 2014-06 论文的撰写及答辩