皖北黄牛MHC基因遗传多样性及分子系统关系
- 格式:pdf
- 大小:275.77 KB
- 文档页数:6
皖北黄牛MHC基因遗传多样性及分子系统关系1魏磊宿州职业技术学院234000摘要:对6个地方皖北黄牛品种共计50个个体的MHC基因序列305bp进行分析,检测到7种单倍型,其核苷酸多态位点24个,约占所测核苷酸总长的7.86%,其中有18个转换,1个颠换,5个转换/颠换。皖北黄牛品种单倍型间的序列差异在0.26~4.53%之间,单倍型多样度(H)为0.602~0.617,核苷酸多样度(π)为0.012~0.019,表明皖北黄牛MHC基因遗传多样性并不丰富。根据15个MHC基因序列,以水牛作外群,采用最大似然法(maximumlikelihood、ML)构建分子系统发育树。聚类表明,皖北黄牛与鲁西黄牛具有较近的亲缘关系。关键词:皖北黄牛;MHC基因;遗传多样性;分子系统关系
GeneticdiversityofMHCgeneandmolecularphylogenyofWanbeicattleWeileiSuzhouvocationaltechnologycollege,Anhui,Suzhou,234000,ChinaAbstract:MHCsequences(305bp)of50samplesobtainedfrom6Wanbeilocalcattlebreedswereanalyzed.Theresultsrevealed7MHChaplotypes,24polymorphicsites,covering7.86%oftheentirelengthofthesequences.Amongthesepolymorphicsites,therewere18transitions,1tranversionsand5transition/tranversion.Thenucleictidesequenceofhaplotypewas0.26%~4.53%.Thenucleotidediversity(πvalue)andhaplotypediversity(H)were0.602~0.617and0.012~0.019,respectively,indicatingpoorMHCgeneticdiversityinWanbeicattle.Themaximumlikelihood(ML)methodwereemployedtoreconstructthemolecularphylogenetictreeofWanbeicattlebreedsbasedon15MHCsequenceswithwaterbuffaloasoutgroup.TheMLtreeindicatedthatWanbeicattlewasrelativelyclosertoLuxicattle.Keywords:Wanbeicattle;MHCgene;geneticdiversity;molecularPhylogeny
我国是世界上黄牛品种资源最丰富的国家之一。按照其地理分布区域分为北方黄牛、中原黄牛和南方黄牛三大类型[1]。按形态特征可把中国地方黄牛分为49个品种[2]。关于
1基金项目:宿州科技攻关项目,课题编号为2009021
作者简介:魏磊(1969-),男,河南永城人,副教授,博士,研究方向:动物分子地理学与系统发育学中国黄牛的起源,学术界有不同的观点。通过对黄牛Y染色体多态性分析,陈宏等[3]认为北方黄牛受普通牛的影响大,南方黄牛受瘤牛的影响大,中原黄牛同时受普通牛和瘤牛的影响。而基于mtDNARFLP研究,Yuetal[4]发现中国南方部分牛种单倍型中,Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型分别与普通牛、瘤牛与牦牛一致。通过对中国20个牛种血液蛋白多态性进行研究后,陈幼春[5]则认为中国黄牛起源于普通牛、瘤牛、斑腾牛、印度野牛和非洲瘤牛。皖北黄牛是安徽省皖北地区饲养量最大的地方黄牛品种,然而自上世纪80年代以来,大量引进外来品种以及冷冻胚胎,对皖北黄牛的种资源产生了极大地冲击,致使皖北黄牛固有品种的优良特性、基因组合体系因杂交而解体。因此,从分子水平对皖北黄牛品种的遗传多样性、亲缘关系及起源进化进行研究,对合理保护和开发利用皖北黄牛品种资源已是十分紧迫的课题。MHC即主要组织相容性复合体(MajorHistocompati-bilityComplex.MHC)由紧密连锁、高度多态的基因位点所组成的染色体上的一个区域[6]
,在
机体的免疫应答调控和免疫识别过程中发挥着重要的作用,与动物对疾病的易感性和抗性存在密切的关系。同时,MHC基因的高度多态性与突变、选择、重组和基因转变等遗传作用有关,可以真实地反映家畜的起源与进化,是一个很好的遗传标记,已经在动物的系统发育、演化及遗传多样性方面得到了广泛的应用。目前,对皖北黄牛MHC基因的研究较少,本文以MHC基因为分子标记,通过对皖北黄牛开展MHC基因遗传多态性的分析,获得其种群结构及种群进化历史,再结合品种分布的地理位置等信息,为皖北黄牛的遗传资源保护、开发与利用提供科学依据。1材料与方法1.1样本来源在宿州、淮北、濉溪、泗县、灵璧、符离镇等地皖北黄牛品种的主产区采集50个血样(表1),另外又采集了哈萨克牛、蒙古牛、延边牛、鲁西牛、秦川牛、南阳牛、晋南牛、闽南牛、吉安牛、早胜牛、郏县红牛、西镇牛、宣汉牛、雷琼牛14个地方黄牛品种的血样。所采集的样品置于−80℃保存。表1皖北黄牛的采样地及遗传多样性指标Table1CollectionlocationandgeneticdiversityindicesofWanbeicattle采集地样本数单倍型单倍型多样度(H)核苷酸多样度(π)
CollectionlocationSamplesHaplotypeHaplotypediversityNucleotidediversity
宿州940.613±0.1210.016±0.004淮北1040.605±0.0270.017±0.003濉溪840.617±0.1240.016±0.002泗县620.602±0.1300.012±0.001灵璧1040.608±0.0350.019±0.002符离镇730.604±0.1310.013±0.002
1.2DNA提取、PCR扩增与测序
按照常规的酚-氯仿法提取黄牛的DNA。所提取的DNA置于−20℃保存备用。根据已有的序列设计一对引物(上游引物序列为5’-ATCCTCTCTCTGCAGCACATTTCC-3’;下游引物序列为5’-TTTAAATTCGCGCTCACCTCGCCGCT-3’),引物由上海生
工合成。PCR反应都在PTC-200型DNA扩增仪上进行。反应总体系为30μl,其中含有10mmolTris-HCl(pH8.3),50mmolKCl、1.5mmolMgCl2,100μmoldNTPs,引物各
0.25mol,1UTaqDNA聚合酶,总DNA约为25ng。反应程序为:94℃变性45s,52~60℃复性50s,72℃延伸50s,共进行32个循环。循环前95℃预变性5min,循环后继续延伸7min。为防止污染,所有PCR反应都设立空白对照组;扩增产物使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,用BioStarGlass-milkDNA纯化试剂盒回收,纯化后的线粒体基因使用ABI3730测序仪(美国)测序。为保证所测序列的可靠性,每一样品均进行双向测序。1.3数据处理
用ClustalX软件和DNASTAR软件包中的SeqMan程序对中国黄牛50条MHC序列进行人工校正与比对。用DnaSP4.0软件统计MHC单倍型及核苷酸多态性指标。为了探讨皖北黄牛起源和分化,同时测出了我国14个地方黄牛品种的MHC基因序列,以水牛为外群,采用最大似然法(maximumlikelihood、ML)构建分子系统发育树。ML分析在PAUP*4.0b10[7]中完成,构树参数设置如下:选择启发式搜索(heuristicsearch)、树二等分再连接选项(tree-bisectionreconnection,TBR)和100次随机加入序列(additionsequencereplicates)等参数进行搜索最大似然树。所有位点均作无序特征处理,分析前
排除所有无信息位点。检验ML树中各节点可信度采用非参数自展法(non-parametricbootstrap)重复检测,用自展值(1000replicates)来检验各节点的支持率,置信度
(bootstrapvalues)>70%为有意义支持,置信度(bootstrapvalues)在50~70%为无效支持[8]
,
参数设定:nreps=1000,search=heuristic,conlevel=50,addseq=random,swap=TBR。2结果
2.1皖北黄牛MHC变异与遗传多样性
对皖北黄牛50条MHC序列305bp进行分析,检测到24个变异多态位点,占分析位点的7.86%,包括18个转换,1个颠换,5个转换/颠换。在皖北黄牛50条MHC序列中,界定了7种MHC单倍型,用WBB1-WBB7表示。研究发现WBB1、WBB5和WBB7是50个个体中出现频率最多和最主要的单倍型。单倍型WBB1共出现16次,WBB5共出现10次,WBB7共出现8次。WBB2单倍型为宿州黄牛样品特有,共出现5次。WBB4和WBB6单倍型为淮北黄牛和濉溪黄牛样品特有,共出现6次。单倍型WBB3为灵璧黄牛样品特有,共出现5次。单倍型间的序列差异在0.26~4.53%之间,单倍型数为2~4个,单倍型多样度(H)为0.602~0.617,核苷酸多样度(π)为0.012~0.019(表1)。2.2皖北黄牛系统发生分析基于MHC基因所获得的ML树见图1。15个黄牛品种分为三大支系,第I支系由哈萨克牛、蒙古牛和延边牛组成;第II支系由鲁西牛、早胜牛、郏县红牛、西镇牛和皖北牛组成;第III支系由南阳牛、闽南牛、吉安牛、宣汉牛和雷琼牛组成。从构建的拓扑树可看出,三支系内各分支都有较高的自展值支持;其中,皖北牛以高自展值与鲁西牛聚为姐妹群(96%),随后它们一起与(秦川牛,晋南牛)这一分支构成姐妹群。
图1.基于MHC基因构建的ML树。分支上方数字代表置信度。Fig1.MLtreebasedonMHCsequences.Bootstrapvalueswereabovebranches.
3讨论3.1皖北黄牛遗传多样性对黄牛的种群遗传结构研究,用不同的研究方法所得出的结果并不相同。基于线粒体基因研究认为,群体中mtDNA核苷酸多样度(π)值是衡量群体多态程度和群体遗传分