高等植物基因工程HEWenxingUNIVERSITYOFJinan第二节植物基因工程方法一、植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：（一）生物介导的转化方法主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
（二）直接基因转移技术包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等其中基因枪转化法是代表。
第二节植物基因工程方法一植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：（一）生物介导的转化方法主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
（二）直接基因转移技术包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等其中基因枪转化法是代表。
HEWenxingUNIVERSITYOFJinan、农杆菌的Ti质粒与TDNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染而产生根瘤。
它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（Atumefaciens）。
其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。
（一）生物介导的转化（一）生物介导的转化农杆菌的Ti质粒与TDNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染而产生根瘤。
它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（Atumefaciens）。
其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。
农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮这些酚类物质可以诱导Vir （Virulenceregion)基因的启动表达Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T －DNA结合形成复合物转化植物根部细胞。
HEWenxingUNIVERSITYOFJinanTi质粒（Tumorinducedplasmid）Ti质粒（Tumorinducedplasmid）环状dsDNA,kb具六个功能区致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解Ti质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移毒性区（Vir）（Virulenceregion)：直接参与TDNA的转移和插入植物染色体DNA复制区（Re织、细胞、细胞器内完成整合并表达的基因转化的方法。
最早是由Cornell大学研制的火药基因枪。
年美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS系统。
基因枪的组成部分由点火装置、发射装置、挡板、样品室、真空系统组成。
基因枪法基因枪法（particlegun）又称微弹轰击法（microprojectilebombardment,particlebombardment,biolistic)。
它是把遗传物质或其它物质附着于高速微弹上直接射入组织、细胞、细胞器内完成整合并表达的基因转化的方法。
最早是由Cornell大学研制的火药基因枪。
年美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS系统。
基因枪的组成部分由点火装置、发射装置、挡板、样品室、真空系统组成。
基因枪转化的基本步骤如下：DNA微弹的制备DNA微弹载体的制备靶外植体准备DNA微弹轰击轰击后外植体的培养HEWenxingUNIVERSITYOFJinan（）动力系统炸药爆破力gunpower高压气体（highpressuregas）高压放电（）DNA颗粒载体的制备利用CaCl对DNA沉淀作用亚精氨、PEG的粘附等作用将DNA固定在颗粒表面。
（）动力系统炸药爆破力gunpower高压气体（highpressuregas）高压放电（）DNA颗粒载体的制备利用CaCl对DNA沉淀作用亚精氨、PEG的粘附等作用将DNA固定在颗粒表面。
HEWenxingUNIVERSITYOFJinan（）金属颗粒金粉：规则的球形比表面积大DNA吸附力强钨粉：廉价易得但易在细胞表面形成有害的氧化物（）金属颗粒金粉：规则的球形比表面积大DNA吸附力强钨粉：廉价易得但易在细胞表面形成有害的氧化物HEWenxingUNIVERSITYOFJinan基因枪转化率基因枪转化率差异很大一般在~之间。
McCabe在大豆上高达而有的报道仅有。
相对于农杆菌介导的转化率要低得多而且基因枪转化成本高嵌合体比率大、遗传稳定性差。
基因枪转化率基因枪转化率差异很大一般在~之间。
McCabe在大豆上高达而有的报道仅有。
相对于农杆菌介导的转化率要低得多而且基因枪转化成本高嵌合体比率大、遗传稳定性差。
HEWenxingUNIVERSITYOFJinan尽管基因枪法有很多缺陷但在单子叶植物上也有广泛应用优点有：a)无宿主限制无论是单子叶植物和双子叶植物都可以应用。
b)受体类型广泛原生质体、叶圆片、悬浮培养细胞、茎、根、以及种子的胚、分省组织、愈伤组织、花粉细胞、子房等几乎所有具有分生潜力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击。
c)可控度高商品化的基因枪都可以根据实验需要调控微弹的速度和射入浓度命中特定层次的细胞。
d)操作简便迅速。
正因为基因枪这些优点使基因枪成功的应用于：植物基因转化特别是单子叶植物的转化外源基因导入植物细胞器种质转化（茎尖分生组织、配子体、胚胎细胞）植物基因表达调控研究。
基因枪法优点：尽管基因枪法有很多缺陷但在单子叶植物上也有广泛应用优点有：a)无宿主限制无论是单子叶植物和双子叶植物都可以应用。
b)受体类型广泛原生质体、叶圆片、悬浮培养细胞、茎、根、以及种子的胚、分省组织、愈伤组织、花粉细胞、子房等几乎所有具有分生潜力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击。
c)可控度高商品化的基因枪都可以根据实验需要调控微弹的速度和射入浓度命中特定层次的细胞。
d)操作简便迅速。
正因为基因枪这些优点使基因枪成功的应用于：植物基因转化特别是单子叶植物的转化外源基因导入植物细胞器种质转化（茎尖分生组织、配子体、胚胎细胞）植物基因表达调控研究。
HEWenxingUNIVERSITYOFJinan多聚物介导转化：利用多聚物PEG、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等在二价阳离子作用下促进DNA在原生质体表面形成沉淀继而通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入细胞内。
多聚物促进细胞融合的原理：多聚物使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥促进相互间的接触和粘连在细胞融合的过程中DNA 进入细胞。
多聚物介导转化：利用多聚物PEG、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等在二价阳离子作用下促进DNA在原生质体表面形成沉淀继而通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入细胞内。
多聚物促进细胞融合的原理：多聚物使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥促进相互间的接触和粘连在细胞融合的过程中DNA 进入细胞。
HEWenxingUNIVERSITYOFJinan磷脂介导（Phospholipidsasgenedeliveryvehicles）脂质体(liposomes)是一种人造的脂质小泡外周是脂双层内部是水腔。
HEWenxingUNIVERSITYOFJinan电穿孔法将高浓度的质粒DNA 加入到植物细胞的原生质体悬浮液中混合物在Vcm的电场中处理若干秒钟然后将原生质体在组织培养基中生长周再生出整株植物。
电穿孔法将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中混合物在Vcm的电场中处理若干秒钟然后将原生质体在组织培养基中生长周再生出整株植物。
HEWenxingUNIVERSITYOFJinan（）定义：利用显微注射仪通过机械方法将DNA注入细胞质或核内。
显微注射法（microinjection):显微注射法（microinjection):（）定义：利用显微注射仪通过机械方法将DNA注入细胞质或核内。
HEWenxingUNIVERSITYOFJinan（）细胞固定（对植物来言）：琼脂糖包埋法多聚赖氨酸粘连吸管支持法（）优缺点：转化率高甚至繁琐耗时需要专门的显微注射仪要求精密操作技术和低密度培养技术。
（）细胞固定（对植物来言）：琼脂糖包埋法多聚赖氨酸粘连吸管支持法（）优缺点：转化率高甚至繁琐耗时需要专门的显微注射仪要求精密操作技术和低密度培养技术。
HEWenxingUNIVERSITYOFJinan、花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道将外源DNA导入受精卵细胞并被整合到受体细胞的基因组中随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。
该方法于年代初期由我国学者周光宇提出我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。
该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株技术简单不需要装备精良的实验室常规育种工作者易于掌握。
利用花粉管通道将DNA转移至胚囊转化尚不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎组织。
目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。
、花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道将外源DNA导入受精卵细胞并被整合到受体细胞的基因组中随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。
该方法于年代初期由我国学者周光宇提出我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。
该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株技术简单不需要装备精良的实验室常规育种工作者易于掌握。
利用花粉管通道将DNA转移至胚囊转化尚不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎组织。
目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。
HEWenxingUNIVERSITYOFJinan采用某种转基因方法处理外植体后通常外植体中仅有少数细胞获得转化。
只有采取有效的筛选方法才能高效准确地选择到转化细胞。
筛选方法主要有两种：解毒基因筛选选择基因为一解毒基因可以消除培养基中有害物质（如抗生素、除草剂等）对细胞生长的抑制作用而非转化细胞不能在含有有害物质的培养基中生长。
营养缺陷型筛选受体细胞为营养缺陷型细胞不能在选择性培养基中增殖而选择基因可以补偿这种缺陷使转化细胞在选择性培养基上正常生长。
第三节转化子细胞的筛选第三节转化子细胞的筛选采用某种转基因方法处理外植体后通常外植体中仅有少数细胞获得转化。
只有采取有效的筛选方法才能高效准确地选择到转化细胞。
筛选方法主要有两种：解毒基因筛选选择基因为一解毒基因可以消除培养基中有害物质（如抗生素、除草剂等）对细胞生长的抑制作用而非转化细胞不能在含有有害物质的培养基中生长。
营养缺陷型筛选受体细胞为营养缺陷型细胞不能在选择性培养基中增殖而选择基因可以补偿这种缺陷使转化细胞在选择性培养基上正常生长。
HEWenxingUNIVERSITYOFJinan一、植物基因工程中的选择基因植物基因工程中的选择标记基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。
