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红蘑多糖的纤维柱层析分离纯化

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食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用

· 170 ·2012年 第37卷 第12期

红蘑(Gomphidius rutilus)学名血红铆钉菇，东北地区俗称红蘑、松树伞、松蘑等。其子实体无任何毒性，富含多糖，其药用价值主要体现在真菌多糖的生物活性上，尚未实现人工培育[1]。真菌多糖提取的传统工艺有热水浸提法、酸提法、

收稿日期：2012-05-24 基金项目：鞍山科技计划项目(08SF24)。作者简介：李书倩(1975—)，女，博士研究生，副教授，研究方向为食品生物技术。碱提法等，新兴工艺包括酶提法、超声波辅助法、微波辅助浸提法等[2]。在粗多糖提取后，采用离子交换层析法是生物化学领域中常用的一种层析方法。离子交换层析(Ion Exchange Chromatography，李书倩1,2，辛 广1,2，张 博1,2(1.鞍山师范学院化学系，鞍山 114007；2.沈阳农业大学食品学院，沈阳 110161)摘要：选择野生红蘑作为提取多糖的原料，采用预处理后的DEAE-52纤维素粉末制成OH-型柱对红蘑中的多糖进行分离纯化，结果表明：在上样量为200 mg、洗脱速度为0.5 mL/min的条件下洗脱，得到4个主峰，依次为GRPⅠ、GRPⅡ、GRPⅢ和GRPⅣ，其中GRPⅠ出现在水洗脱部分，GRPⅡ、GRPⅢ和GRPⅣ分别出现在0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl、1.0 mol/L NaCl洗脱部分。经计算，GRPⅠ、GRPⅡ、GRPⅢ和GRPⅣ分别占12.6%、8.7%、22.3%和27.6%。关键词：红蘑；多糖；DEAE-52纤维素；纯化中图分类号：R 284.2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2012)12-0170-04

Separation and purification of Gomphidius rutilus polysaccharides by column chromatography LI Shu-qian1,2, XIN Guang1,2, ZHANG Bo1,2(1.Chemistry Department of Anshan Normal University, Anshan 114007; 2.Food College of Shenyang Agriculture University, Shenyang 110161)Abstract: The primary purification of the polysaccharides extracted from Gomphidius rutilus was carried out by DEAE-52 cellulose chromatography, which was as a vector after pretreatment. The results show that, the four kinds of pure polysaccharide named GRPⅠ, GRPⅡ, GRPⅢ and GRPⅣ were mainly obtained when the adding sample was 200 mg and the rate of flow was 0.5 mL/min. GRPⅠ appeared undergoing distilled water elution in column chromatography. GRPⅡ, GRPⅢ and GRPⅣ appeared undergoing NaCl gradient elution with the concentration 0.1 mol/L, 0.3 mol/L and 1.0 mol/L in column chromatography. The ratio of them were12.6%, 8.7%, 22.3% and 27.6% respectively.Key words: Gomphidius rutilus; polysaccharide; DEAE-52 cellulose; purification红蘑多糖的纤维柱层析分离纯化食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用

· 171 ·2012年 第37卷 第12期简称为IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂等[3]。纤维素是世界上最丰富的有机化合物，也是人类应用最多的一种高聚糖纤维素，具有开放性的长链和疏松的网状结构有利于大分子的渗透和吸附纤维素结构中存在着大量的羟基，可通过各种反应制成多种纤维素衍生物而带有各种活泼基团[4]。本文采用DEAE-52纤维素对红蘑多糖进行纯化分离，为开发利用这一天然多糖资源提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂野生红蘑：原产地黑龙江，烘干、粉碎过40目筛备用。离子交换纤维素DEAE-52(whatmanBI2070)、无水乙醇、氢氧化钠、丙酮、苯酚、氯仿、正丁醇、浓硫酸、过氧化氢、浓盐酸，氢氧化钠、草酸、氯化钠：分析纯。1.2 仪器与设备FZ102型微型植物粉碎机，TU-1810紫外可见分光光度计，SHB-B95型循环水式多用真空泵，RE-52旋转蒸发器，DZF型真空干燥箱，DELTA320pH酸度计，PL2002电子天平，分析天平，层析柱(1.6 cm×50 cm)，DHL-A电脑恒流泵，DBS-100电脑全自动部分收集器，FD-1-50真空冷冻干燥机，CR22E冷冻离心机。1.3 方法1.3.1 红蘑多糖粗提液的制备1.3.1.1 红蘑多糖的提取 将干制的野生红蘑磨粉，过40目筛，收集筛下物，称取4 g放入三角瓶中，按料水比1:35的比例加入140 mL蒸馏水，共4份。超声波振荡破壁16 min，在温度为100 ℃的条件下，水浴加热浸提105 min，真空抽滤去除残渣，将浸提液在80 ℃的条件下旋转蒸发，浓缩至较小体积。1.3.1.2 红蘑多糖提取液的醇沉 在浓缩后的多糖浸提液中加入3/4体积的98%乙醇溶液，充分混合后静置24 h，真空抽滤去除多余溶液，收集沉淀并烘干。1.3.1.3 红蘑粗多糖的复溶 将烘干的红蘑粗多糖在70 ℃的条件下用蒸馏水溶解，制成红蘑多糖粗提液。1.3.2 Sevage法脱蛋白[5] 在多糖溶液中按5:1的比例加入Sevage试剂[三氯甲烷:正丁醇=5:1(v/v)]，用磁力搅拌器充分搅拌30 min，12000 r/min离心分离10 min，放入分液漏斗中静置5 min，取水相，重复上述步骤，直至界面无蛋白为止。1.3.3 过氧化氢法脱色[6] 多糖溶液用2% NaOH调pH8~9，加入30%过氧化氢使终浓度为10%，60 ℃保温3 h后，冷却至室温，草酸调pH至7.0，加热去除过氧化氢，将多糖溶液用旋转蒸发仪在80 ℃条件下浓缩至较小体积后冷藏备用。1.3.4 红蘑多糖粉末的制备 将粗多糖浓缩液放于小烧杯中，液层高度控制在1~2 mm，在-57 ℃条件下真空冷冻干燥24 h，得到白色结晶，收集后密封，放于冰箱中冷藏备用。1.3.5 红蘑多糖的DEAE-Cellulose柱层析 按常规方法处理后[7]，将处理好的DEAE-52纤维素装入玻璃层析柱，装填高度20 cm，用蒸馏水平衡5 h，上样量200 mg，然后依次用蒸馏水和0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5、2.0 mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱速度为0.5 mL/min，每管收集5 mL。苯酚-硫酸法隔管跟踪检测，分别收集洗脱峰，直至无糖组分流出，依吸光度对洗脱液管号作图，得到洗脱曲线。合并相同峰位的组分，冷冻干燥，分别得到水洗脱和盐洗脱的不同组分多糖。1.3.6 多糖测定 苯酚-硫酸法[17]。标准曲线制作：准确称取105 ℃干燥恒重的葡萄糖100 mg，溶解定容于100 mL容量瓶中，得1.0 mg/mL葡萄糖的对照品储备溶液，备用。精密移取对照品储备液0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL，分别置于8个100 mL容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，制成不同浓度的标准溶液。然后从各瓶中分别移取1.0 mL标准溶液置于10 mL具塞比色管中，加入6%苯酚溶液1.0 mL，摇匀后快速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后放置5 min，置沸水浴中加热20 min，取出后冷却至室温，以第1瓶溶液为参比溶液，于紫外可见分光光度计上测定490 nm波长处的吸光度。以葡萄糖浓度对吸光度作图，绘制标准曲线，并计算线性回归方程。多糖纯度[18](%)=多糖质量(g)/粗多糖总量(g)×1002 结果分析2.1 葡萄糖溶液标准曲线的制作食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用

· 172 ·2012年 第37卷 第12期红蘑多糖的主要组成成分，结果见表2。表2 GRP的DEAE-52纤维素柱层析结果样品质量/mg占粗多糖比例/%上柱前红蘑粗多糖20010.2GRPⅡ-a20.42.2.3 0.3 mol/L NaCl洗脱结果图1 葡萄糖标准曲线

图2 GRP的DEAE-52 Cellulose柱色谱图

图3 GRP的DEAE-52 Cellulose柱色谱图图4 GRP的DEAE-52 Cellulose柱色谱图

图5 GRP的DEAE-52 Cellulose柱色谱图Z󰀁󰀞󰀁󰀑󰀏󰀒󰀖󰀚󰀘Y󰀎󰀑󰀏󰀑󰀑󰀕󰀓3󰀓󰀁󰀞󰀁󰀑󰀏󰀚󰀚󰀗󰀓

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红稗多糖的分离纯化工艺

红稗多糖的分离纯化工艺

红稗多糖的分离纯化工艺

苏伟;李静雯;李泽秀;母应春

【摘 要】In order to study deproteinization process of polysaccharide from

bacca sedge with different methods, the optimum conditions of DEAE-52

cellulose exchange chromatography column were determined, then the

purified polysaccharides were separated and purified by Sephadex G-100

column chromatography, and the monosaccharide composition of the

purified polysaccharides was determined by pre-column derivatization

HPLC.Results: The optimal sample concentration, elution rate and sample

volume were respectively 5 mg/mL, 0.5 mL/min and 25 mL.Protein removal

rate and the polysaccharide storage rate were higher by sevage

method.After separation and purification by DEAE-52 cellulose, a large

polysaccharide was obtained by Sephadex G-100, then isolated and

purified by column chromatography and high performance liquid

香菇多糖的分离提取

香菇多糖的分离提取

香菇多糖的分离提取

一、实验目的

掌握水溶醇沉法分离多糖类化合物的原理和方法。

二、实验原理

在组织中，多糖多与蛋白质以共价相结合，所以在生化产品制备工艺中，往往第一步多用酶降解蛋白质部分或用碱使多糖—蛋白质间的键裂开，以促进多糖

在提取时的溶解。碱性提取可避免多糖中硫酸基团水解而破坏。现多采用碱性提取的同时用蛋白质水解酶处理组织。提取液中存在的蛋白质可用普通蛋白质沉

淀剂使之沉淀，也可用其他方法使变性沉淀，如适当调pH和加热等。

苯酚试剂可与香菇多糖中的已糖及其糖醛酸起显色反应，生成橙黄色化舍橱，于49Ohm处比色，定量。

三、实验材料

1.实验器材

循环水式真空泵；旋转蒸发仪； 粉碎机；恒温水浴锅；纱布；搪瓷缸；真空干燥器；721型分光光度计；15ml具塞试管。

2．实验试剂

（1）95%乙醇；甲醇（化学纯）；乙醚（化学纯）；木瓜蛋白酶（中性）；纤维素酶；0.2 mol/L十六烷基三甲基氢氧化铵水溶液；10 mol/L 氢氧化钠溶液；葡萄糖标准溶液(1mg/ml，10m/m])；苯酚试液。

（2）复合酶液：以PBS缓冲液做溶剂，其中蛋白水解酶浓度为8 %，纤维素酶浓度为4%；

（3）苯酚溶液：称取苯酚(AR级)10 g加水190 g溶解后，置于棕色瓶，备用。

四、实验方法步骤

（一）香菇多糖的分离

1、预处理：取干香菇4 g，用粉碎机粉碎或捣碎。 2、提取：将捣碎的干香菇置于250 ml三角瓶中，在搅拌的条件下加7倍量水混匀, 加热至90℃，搅拌保温60 min，降温至40℃时转移到40℃水浴保温；并加入适量0.45 ml 复合酶（蛋白水解酶浓度为8 %，纤维素酶浓度为4%），pH值为自然(pH 6.4)，搅拌反应60 min，然后迅速升温到90-100 ℃，灭活1min，降温后纱布过滤，收集滤液。

3、浓缩：将以上滤液置于旋转蒸发仪中，然后减压浓缩至l/5体积时，停止浓缩。

4、沉淀：将浓缩液置于搪瓷缸中，在搅拌的条件下，加1 倍量乙醇，然后静置过夜。过滤得沉淀物，滤液再加3倍量乙醇，得沉淀物。

香菇中糖类物质离与测定

香菇中糖类物质离与测定

香菇中糖类物质离与测定

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香菇中糖类物质的分离与测定

摘要：本实验采用热水浸提和乙醇醇沉的方法提取香菇多糖（Lentinan，LNT），利用正交法得出最佳提取粗多糖的方案，得到的粗多糖回收率为14.05﹪，再对得到的粗多糖进行定性、定量分析。用苯酚—硫酸法测定已提取出的粗多糖中单寡糖与多糖的含量为35.9%；经过薄层层析和纸层析法分析单糖的组成，其中组成多糖的单糖多属于葡萄糖和阿拉伯糖；用Sepharsose CL—6B柱层析法测定多糖的相对分子量约为5597.58道尔顿。气象色谱分析单糖含的结果是香菇多糖中的单糖种类有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、岩藻糖等，其中含量较多的半乳糖和葡萄糖。

关键字：香菇多糖 回收率 含量 组成 相对分子量

Separation and Determination of carbohydrates in

Lentinus edodes

Abstract：This experiment extracts of lentinan (Lentinan LNT) by using hot water

extraction and ethanol alcohol precipitation method. The orthogonal method to get

the optimum extraction of polysaccharides is the best program, resulting

超滤法分离与纯化香菇多糖

超滤法分离与纯化香菇多糖

超滤法分离与纯化香菇多糖范云鹏1,李十中13,刘冬梅1,王星云2,熊先锋2Ξ(11天津大学化工学院,天津　300072;21禹城福田药业有限公司,山东禹城　251200) 香菇Lentinusedodes(Berk1)Sing1是一种食药用菌,其主要药用成分为香菇多糖,含量约为1218mg󰃗g[1]。相对分子质量为400000～800000的香菇多糖具有抗癌活性,通过调节胞质分裂增强身体免疫系统功能[2]。而且香菇多糖还对艾滋病有一定疗效[3] 香菇多糖的纯化主要采用有机溶剂分级沉淀法[4],色谱法[5]等。但有机溶剂法易引入有害物质,色谱法设备昂贵、复杂,产率低,成本太高。近年来有采用超滤法[6]提取香菇多糖的研究,可以降低成本,提高产率,但产品纯度较低。为充分发挥膜分离技术的优势,探索多糖分离纯化的新方法,本研究采用超滤2渗滤法改善产品纯度,并引入冷冻干燥技术,改进香菇多糖的提取纯化工艺,以期提高产品收率、降低成本。1　材料与方法111　材料与仪器:香菇由福建省古田县福佳食品有限公司提供。超滤膜(截流相对分子质量为50000、20000、10000和4000的高分子合金膜,滤膜的有效面积为43cm2)由中国科学院上海原子核研究所提供。PB3032N型电子精密仪器天平[梅特勒・托利多(上海)有限公司],752型紫外光栅分光光度计(上海第二光学仪器厂),5—DX傅立叶变换红外光谱仪(Nicolet,美国),LGJ—10冷冻干燥机(北京四环科学仪器四厂)。112　方法:称取10g香菇,粉碎后用乙醇浸泡除去杂质,按固液比10∶1加入蒸馏水,于90℃水浴恒温搅拌浸提6h,4000r󰃗min离心分离除去大部分固体物质,然后采用015Λm膜微滤得到香菇多糖提取液。2　结果与讨论211　多糖溶液中相对分子质量的分布:在室温、013MPa下,把香菇多糖的提取液依次用截留相对分子质量为50000、20000、10000和4000的滤膜进行渗滤,多糖溶液则被分为5份,然后用硫酸2蒽酮法测定每段溶液中总糖的含量,提取液中糖的相对分子质量分布见图1。相对分子质量为50000以上的多糖约占总糖的2010%,而相对分子质量4000以下的寡糖和单糖约占3713%。与有机溶剂分级沉淀法相比,超滤分级纯化可以很方便得到香菇多糖的相对分子质量分布,对多糖纯化及药理研究都有指导意义。