化妆品体外哺乳动物细胞微核试验
In Vitro Mammamlian Cells Micronucleus
Test
1 范围
本方法规定了体外哺乳动物细胞微核试验的范围、试验目的、定义、试验基本原则、试验材料与试剂、试验步骤、结果判定标准。
本方法适用于化妆品原料或产品的致突变性的检测。
2 试验目的
本试验用于检测体外培养的哺乳动物细胞染色体损伤和非整倍体变异，以评价受试物致突变的可能性。
3 定义
3.1 微核micronuclei
染色单体或染色体的无着丝粒断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，无法迁移至两极而遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。
3.2 着丝粒centromere
染色体中将两条姐妹染色单体结合起来的DNA区域。
3.3 非整倍体aneuploidy
二倍体染色体组中缺少或额外增加一条或若干条完整的染色体的变异类型。
3.4 非整倍体诱变剂aneugen
作用于细胞有丝分裂或者减数分裂周期，导致细胞分裂异常，诱发非整倍体的物质。
3.5 染色体断裂chromosome breakage
染色体臂出现长度大于染色体臂宽度的裂隙。
3.6 染色体断裂剂clastogen
引起染色体发生断裂的物质。
3.7 细胞毒性cytotoxicity
对细胞结构或功能的有害效应，最终可导致细胞死亡。
3.8 致突变性mutagenicity
导致基因或染色体结构中产生可遗传的DNA碱基对序列变化的能力。
4 试验基本原则
体外哺乳动物细胞微核试验是一种用于检测哺乳动物细胞经受试物处理后是否产生微核的致突变性检测方法。本方法适用于检测有丝分裂细胞暴露于受试物期间或之后致染色体断裂和/或诱发非整倍体的能力。如果短期（3 h～6 h）处理的试验结果为阴性或不明确时，需要进行无代谢活化系统的长期处理试验（用受试物处理细胞1.5～2.0个正常细胞周期）。
试验分为使用和不使用肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B（CytochalasinB，cytoB）两种方法。方法一：在细胞经过受试物处理，有丝分裂前使用cytoB，然后观察分析已完成一次有丝分裂的细胞（双核细胞）微核率。方法二：不使用cytoB，细胞经过受试物处理后观察分析细胞微核率。当选用人类淋巴细胞时，建议采用方法一，因为不同来源的细胞周期不同，而且不是所有的细胞都对植物血球凝集素（PHA）有反应。如果有证据表明受试物干扰cytoB的活性，或cytoB可能影响细胞的生长（如小鼠淋巴瘤细胞株），建议采用方法二。
5 试验材料与试剂
5.1 细胞株：可选用中国仓鼠肺细胞株（V79或CHL）、中国仓鼠卵巢细胞株（CHO）、小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y）、人类淋巴母细胞株（TK6）或原代培养细胞。细胞在使用前应进行染色体数目稳定性和有无支原体污染的检查。
5.2 培养基：根据细胞类型来选择适宜的培养基。对于V79 、CHL或CHO细胞，常用MEM（Eagle）培养液加入10%胎牛血清和适量抗菌素(可用青霉素100IU/mL、链霉素100μg /mL)。对于L5178Y或TK6细胞，常用RPMI 1640培养液加入10%马血清和适量抗菌素(可用青霉素100IU/mL、链霉素100μg /mL)。
5.3 溶液的配制
5.3.1 活化系统：通常使用的是S9混合物（S9mix）。S9是从经酶诱导剂（Aroclor 1254或苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合使用）处理的啮齿动物肝脏获得的。S9的制备同细菌回复突变试验。S9的使用浓度为1%～10%（终浓度）。S9 mix中所加辅助因子的量由各实验室自行决定，但需确保S9 mix的活性，必须能明显活化阳性对照物。也可使用下述方法配制：
5.3.2 cytoB溶液：用二甲基亚砜（DMSO）配制适当浓度的储备液，避光冷冻保存。cytoB的终浓度通常为3μg/mL～6μg/mL，实验室应根据各种细胞系选择cytoB的适当终浓度，以达到理想的双核细胞出现频率。
5.3.3 0.075 mol/L氯化钾溶液: 5.59g氯化钾加蒸馏水至1000mL。
5.3.4 固定液: 甲醇∶冰醋酸为3∶1（V/V），临用前配制。
5.3.5 姬姆萨（Giemsa）染液：取姬姆萨染料3.8g，置乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375mL，待完全溶解后，再加125mL甘油，放入37℃温箱中保温48h。保温期
间振摇数次，使充分溶解。取出过滤，室温保存，2周后使用，作为姬姆萨染液原液。使用时，取1份姬姆萨染液原液，与9份1/15 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.8）混合，配成其应用液，现配现用。
磷酸盐缓冲液（1/15mol/L，pH 6.8）配制方法如下：
a）第一液：取磷酸氢二钠（Na2HPO4）9.47g溶于去离子水1000mL中，配成1/15mol/L溶液；
b）第二液：取磷酸二氢钾（KH2PO4）9.07g溶于去离子水1000mL 中，配成1/15mol/L溶液；
c）取第一液50mL加于第二液50mL中混匀，即为pH6.8的1/15 mol/L磷酸盐缓冲液。
5.4 溶剂的选择：溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。首选溶剂是培养液（不含血清）或磷酸盐缓冲液（PBS）。当受试物不溶于培养液或PBS时，可选用DMSO作为溶剂，但终浓度不应大于0.5%。
5.5 受试物的浓度选择及配制
5.5.1 受试物浓度设置
5.5.1.1 剂量设置：至少应设置3个可供分析的剂量。受试物没有细胞毒性时，从最高剂量往下设至少2个剂量，一般情况下间隔系数可为2～3；当受试物有细胞毒性时，其剂量范围应涵盖从50%～60%的细胞毒性到几乎无细胞毒性。
5.5.1.2 最高剂量的选择：决定最高剂量的因素是细胞毒性、受试物的溶解度以及pH 值、渗透压。受试物有细胞毒性时，最高剂量应能引起50%～60%的细胞毒性；如果没有细胞毒性或沉淀，最高剂量应是5μL/mL 、5mg/mL 或0.01mol/L 。
对溶解度较低的物质，当浓度达到最大溶解度时仍无毒性，则最高剂量应是在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。在某些情况下，应使用一个以上可见沉淀的浓度，溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不能影响观察。
5.5.1.3 细胞毒性的确定：在S 9存在和不存在两种条件下依据细胞完整性和生长情况的指标来确定细胞毒性。
方法一：使用cytoB ，细胞毒性的确定可依据复制指数（Replication Index ，RI ）或胞质分裂阻断增殖指数（Cytokinesis Block Proliferation Index ，CBPI ）。
100×500
×2+500×2+=RI C T T //多核细胞数）（双核细胞数）多核细胞数（双核细胞数
式中：500为细胞总数；T=受试物组，C=阴性对照组
细胞毒性 = 100 - RI
500
×3+×2+=CBPI 多核细胞数）双核细胞数（单核细胞数 式中：CBPI=1等同于100%细胞生长抑制；500为细胞总数。
100×1
-CBPI 1-CBPI -100=C T 细胞毒性 式中： T=受试物组，C=阴性对照组
方法二：不使用cytoB ，细胞毒性的确定可依据相对
细胞增长数（Relative Increase in Cell Counts ，RICC ）或相对增殖倍数（Relative Population Doubling ，RPD ）。
100×－－=RICC 试验前）
（试验后阴性对照组细胞增加数试验前）试验后受试物组细胞增加数（ 细胞毒性 = 100 – RICC
100×=RPD 阴性对照组细胞倍增数
受试物组细胞倍增数 式中：2log log =//(试验前细胞数）
试验后细胞数双倍数量
细胞毒性 = 100 - RPD
5.5.2 受试物的配制：固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶剂中，并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度。气体或易挥发的受试物应采用适当方法如用封闭式容器或细胞室。受试物应无菌，现用现配，否则须确认储存不影响其稳定性。
5.6 对照的选择
5.6.1 阳性对照物：阳性对照物包括染色体断裂剂和非整倍体剂。加S 9时，断裂剂可以选用环磷酰胺（CAS 号：50-18-0）和苯并芘（CAS 号：50-32-8）；不加S 9时，断裂剂可以选用阿糖胞苷（CAS 号：147-94-4）、丝裂霉素C （CAS
号：50-07-7）、甲磺酸甲酯（CAS号：66-27-3）和4-硝基喹啉（CAS号：56-57-5）；非整倍体剂只用于不加S9时，可以选用秋水仙素（CAS号：64-86-8）和长春碱（CAS号：143-67-9）。
如果短期处理试验方案在S9存在和不存在两种条件下都选用断裂剂作为阳性对照，那么长期处理试验方案应该选用非整倍体剂作为阳性对照。如果选用的细胞本身具有代谢能力，则不需要另外添加S9，阳性对照应该同时使用断裂剂和非整倍体剂。
5.6.2 阴性对照物：应设阴性对照（溶剂），即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其他处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。
6 试验步骤
6.1 细胞准备：将一定数量的细胞接种于培养皿（瓶）中，以收获细胞时培养皿（瓶）的细胞未长满为标准，贴壁细胞一般以长到85%左右为佳。
6.2 受试物处理
6.2.1 方法一：使用cytoB
吸去培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗细胞，加入无
血清培养液及一定浓度的受试物（需代谢活化者同时加入S9mix），置于培养箱中3 h～6 h；结束后吸去含受试物的培养液，用PBS洗细胞2次以上，加入含10%血清的新鲜培养液和cytoB，继续培养至1.5～2.0个正常细胞周期（从加入受试物开始计算）后收集细胞。
对于淋巴细胞，最有效的方法是在有丝分裂原（如PHA）刺激后44 h～48 h开始受试物处理，这时细胞开始进入分裂周期。
如果短期（3 h～6 h）处理的试验结果为阴性或不明确时，需要进行无S9的长期处理试验，用cytoB和受试物处理细胞1.5～2.0个正常细胞周期，在处理结束后收集细胞。
如果已知或怀疑受试物（如核苷类物质）可能影响细胞周期（特别是P53活性细胞），则细胞收获时间应该再延长1.5～2.0个正常细胞周期。
6.2.2 方法二：不使用cytoB
与6.2.1处理方法相同，只是不加cytoB。
6.3 收获细胞与制片：每次培养都应单独收获细胞和制片。
6.3.1 消化：贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化，待细胞脱落后，加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以800r/min～1000r/min 的速度离心5min，弃去上清液。悬浮细胞不需要消化，直接离
心。
6.3.2 低渗：加入0.075 mol/L氯化钾溶液2mL，用滴管将细胞轻轻地吹打混匀，37℃低渗处理1min～5min；如果细胞混合液的分散度良好则不需要进行低渗处理。
6.3.3 固定：加入2mL固定液，混匀后固定5min以上，以800r/min～1000r/min的速度离心5min，弃去上清液。相同步骤，重复一次。
6.3.4 滴片：加入数滴固定液，混匀。用混悬液滴片，自然干燥。
6.3.5 染色：推荐用姬姆萨染色（5%～10%姬姆萨染液，15min～20min），也可用DNA特异性荧光染料（如：吖啶橙或Hoechst 33258）。如果需要区分染色体断裂剂和非整倍体诱变剂，可用荧光原位杂交（FISH）或引物原位标记等方法。
6.4 阅片
6.4.1 微核的判断标准
微核一般为圆形或椭圆形；直径不超过主核的1/3；与主核在一个焦点平面上，与主核的颜色、结构特征及折光性一致；与主核之间没有核物质相连，可以和主核有边界的重叠，但能看清各自的核膜。
6.4.2 方法一：使用cytoB
每个剂量组至少分析2000个双核细胞，计算微核细胞率（一个双核细胞不论含有几个微核，都只算作一个含微核
细胞）。如果单次培养可供计数的双核细胞数少于2000，则应采用多次细胞培养或平行培养，以获得足够分析的细胞。对不规则的双核细胞（如两个核大小相差悬殊）和多于两个核的细胞不进行分析。
6.4.3 方法二：不使用cytoB
每个剂量组至少分析2000个细胞，计算微核细胞率。如果单次培养可供计数的细胞数少于2000，则应采用多次细胞培养或平行培养。
6.5 统计处理：
数据按不同剂量列表，指标包括细胞毒性、观察细胞数、含微核细胞数及微核细胞率。受试物各剂量组与阴性对照组（溶剂对照组）、阳性对照组的微核细胞率用适当的统计学方法（如χ２检验）进行处理。
6.6 结果判定：
符合下列两种情况之一即可判定受试物在本试验系统中为阳性结果：
a）受试物引起微核细胞率的增加具有统计学意义，并与剂量相关；
b）受试物在任何一个剂量条件下，引起的微核细胞率增加具有统计学意义，并有可重复性。
7 结果解释
阳性结果表明受试物在该试验条件下可引起所用哺乳动物细胞染色体损伤或非整倍体变异。阴性结果表明在该试
验条件下受试物不引起所用哺乳动物细胞染色体损伤或非整倍体变异。
九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test 1 范围 本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 3试验目的 本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。 4 定义 染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。 结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。 有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。 5 试验基本原则 在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。当外源性活化系统存在时，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。 6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。 6.1.3 受试物 6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必
第三章红细胞 一、红细胞成熟过程 哺乳类动物红细胞在成熟过程中要经历一系列的变化： 早幼红细胞具有分裂繁殖的能力，细胞中含有细胞核、内质网、线粒体等细胞器； 从骨髓进入尚未完全成熟的红细胞称为网织红细胞，细胞仍有合成血红蛋白的功能，另外也可见有少量线粒体； 红细胞进入外周血1~3天后。核蛋白体等细胞器消失，成为成熟红细胞。 二、红细胞的基本结构 成熟红细胞是结构功能高度特化的细胞，无细胞核，也无细胞器。 红细胞内的主要成分是血红蛋白。血红蛋白是含卟啉铁的蛋白质。约占红细胞重量的33%，易与酸性染料结合，染成橘红色。 成熟红细胞直径7.5~8.5um，呈双凹圆盘状，表面光滑，中央较薄，约1um，周边较厚。约1.9um，在血涂片标本上显示，中央染色较浅周边较深。这一形态结构特点增加了红细胞的表面积，与体积相同的球形结构相比表面积增大约25%，还可使细胞内任何一点距细胞表面的距离都不超过0.85um。由于胞质细胞内充满了血红蛋白，最大限度地增强了气体交换的功能。 红细胞的数量及血红蛋白的含量随生理功能而政变。婴儿高于成人，运动时多于安静状态，高原地区居民高于平原地区居民。红细胞形态和数量以及血红蛋白的质与量的改变超出正常范围，则表现为病理现象。一般认为红细胞计数<3.0×1012/L，血红蛋白<100g/L，则为贫血（anemia）。红细胞计数>7.0×1012/L、血红蛋白>180g/L，则为红细胞和血红蛋白增多。 单个红细胞在新鲜时为淡黄绿色，大量红细胞使血液呈猩红色。多个红细胞常叠连在一起呈緡钱状。 红细胞有一定弹性和形态可变性，它能通过自身的变形而顺利通过直径更小的毛细血管。红细胞正常形态的维持需足够的ATP供能以及细胞内外渗透压的平衡。当缺乏ATP供能时，其形态由圆盘状态变为棘球状，当ATP供能状态改善后亦可恢复。当血浆渗透压降低时，血浆中的水分进入红细胞内，细胞肿胀呈球形甚至破裂，称为溶血，残留的红细胞膜囊称为血影；若血浆渗透压升高，红细胞内水分析出胞外，致使红细胞皱缩，也可导致膜破坏而溶血。 三、红细胞膜的结构 红细胞膜是成熟红细胞存留的唯一细胞器，它对保持红细胞的形态和维持红细胞的生命具有重要的意义。红细胞对外界的所有联系及反应，包括物质运输、免疫反应、信号转导、药物反应等，都由红细胞膜来完成。 人的红细胞膜是由蛋白质（约占49.3%）、脂质（约占42%）、糖类（约占8%）和无机离子等组成，蛋白质与脂质的比值约为1：1。电镜下观察红细胞膜呈三层（暗-明=暗）：外层含糖脂、糖蛋白、蛋白质，为亲水性；中间层含磷脂、胆固醇与胆固醇酯、蛋白质具有疏水性；内层主要包含蛋白质，呈亲水性。即红细胞膜基本结构与其他细胞一样以脂双层为主体，蛋白质镶嵌在脂双层中。蛋白质大多与脂质及糖类结合以脂蛋白或糖蛋白的形式存在。这些蛋白质既有维持红细胞结构的作用，又有各自特定的功能。 1、红细胞膜蛋白 发现红细胞膜上有10种主要蛋白和一些少量蛋白质。 红细胞膜在包膜内表面可见一网状结构支撑着整个细胞，称为膜骨架，主要由血影蛋白、锚定蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白、肌球蛋白、加合素、4.1蛋白、4.2蛋白、4.9蛋白相连接构成。这种网状结构通过锚蛋白固定在细胞膜上。 膜骨架系统对维持红细胞的形状、稳定性起着重要作用。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/df821829.html, 哺乳动物细胞悬浮驯化方法研究进展 作者：陆陈晨谭树华 来源：《科学与财富》2018年第13期 摘要：哺乳动物细胞表达系统是药用蛋白的主要表达方式，传统的贴壁细胞培养有诸多不利，本文介绍常用的贴壁细胞悬浮驯化的方法，通过将贴壁细胞驯化成悬浮细胞，提高哺乳动物细胞表达水平，降低生产成本。 关键词：哺乳动物细胞；驯化；无血清培养 重组蛋白表达是研究蛋白质功能与结构、药物筛选以及后续应用的关键环节，常规的蛋白表达系统有原核表达和真核表达两大类。现代医药工业的快速发展需要重组蛋白拥有接近天然蛋白分子的复杂结构、理化性质和生物功能，特别是糖蛋白及抗体类药物。这就要求表达的重组蛋白需要正确的翻译后修饰、组装和折叠，这是原核表达系统所欠缺的[1-2]。真核表达系统包括酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统，其中以哺乳动物细胞表达系统较为常用。 1 贴壁细胞表达外源蛋白的缺点 传统细胞培养或表达外源重组蛋白采用贴壁细胞进行表达，这种表达方式虽然操作简便，但细胞密度和表达量较低，并且培养时需要加入血清，亦具很多缺点[3]： 1.1 血清组分复杂，含有多种杂蛋白不利于目的蛋白纯化； 1.2 血清批间差异较大，不同批次的血清浓度不稳定，影响工艺的连贯性； 1.3 血清中可能携带有未充分灭活的动物病毒或支原体，有细胞污染和传染人类的风险。 2 细胞无血清悬浮培养的优势 细胞无血清悬浮培养由于具有培养基的化学成分限定、批间产品质量稳定、简化下游生产、生理环境易于控制等优点，在重组蛋白表达、单克隆抗体制备和疫苗生产等中应用广泛。 3 贴壁细胞驯化成悬浮细胞的方法 3.1 分子生物学手段改造 贴壁细胞驯化成悬浮细胞通常有两种方法，一种是通过分子生物学手段，改造贴壁细胞。Noelle-Anne Sunstrom， Sugiyono 等人通过将编码胰岛素样生长因子 I（IGF-I）和转铁蛋白的基因稳定整合到CHO-K1细胞系的基因组中，使用 lac 操纵子/阻遏子系统调控 IGF-I 基因的表
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 哺乳动物成熟红细胞的呼吸方式 哺乳动物的成熟红细胞结构很特殊，既没有细胞核也无线粒体、核糖体等各种细胞器，却富含血红蛋白，这种结构特点与其运输O2的功能是相适应的。 因为无线粒体，红细胞进行无氧呼吸供能。有些学生对此产生疑问：红细胞本身携带O2，却进行无氧呼吸供能，有O2存在时，其无氧呼吸不会受抑制吗？并列举如下理由：①很多种厌氧型的细菌若生活在空气中，其无氧呼吸受到抑制，不能正常生存。②酵母菌等兼性厌氧型的生物生活在氧气充足的环境中进行有氧呼吸，在缺氧的条件下才进行无氧呼吸。 首先明确并不是所有厌氧型的生物都不能生活在有氧环境中，只有那些严格厌氧菌才不能生活在空气中（如光合细菌，产甲烷杆菌等），而耐氧性厌氧菌是可以生活在空气中的。厌氧菌能否生活在空气中，与其体内是否含有超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（或过氧化物酶）有关。细胞代谢过程中会产生自由基，自由基是指那些带有奇数电子数的化学物质，它们都带有未配对的自由电子，具有高度的化学活性。在O2存在时还会产生超氧阴离子自由基，它是活性氧的形式之一，性质极不稳定，化学反应能力极强，在细胞内可破坏各种重要生物大分子和膜结构，还可形成其他活性氧化物，故对生物体极其有害。好氧性生物或耐氧性厌氧菌细胞内可合成SOD和过氧化氢酶（或过氧化物酶），超氧阴离子自由基在SOD作用下被歧化成H2O2，在过氧化氢酶作用下H2O2又进一步转变成无毒的H2O，而严格厌氧菌不能合成SOD，在有O2存在时，由于无法歧化超氧阴离子自由基而身受毒害，无法生存。 红细胞内存在这两种酶（红细胞未成熟前已合成），生活在有氧环境中，不会受自由基的危害而抑制其代谢活动。 酵母菌等兼性厌氧型的生物，在缺氧的条件下进行无氧呼吸，当氧气充足时进行有氧呼吸，其无氧呼吸将会受到抑制。为什么在O2充足时，酵母菌的无氧呼吸会受到抑制呢？已知磷酸果糖激酶是无氧呼吸（糖酵解）过程中关键的限速酶，ATP对磷酸果糖激酶具有抑制作用，在有柠檬酸、脂肪酸时会加强抑制效应，而ADP、AMP、无机磷则对此酶有激活作用，酵母菌有氧呼吸会产生较多的ATP，使ATP/ADP比值增高，无机磷相对减少，有
pGL3-Promoter 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT6010 pGL3--‐Promoter pGL3--‐Promoter载体基本信息 载体名称: pGL3-promoter, pGL3promoter 质粒类型: 荧光素酶报告系统载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 启动子: SV40 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5010bp 5' 测序引物及序列: RV primer3:CTAGCAAAATAGGCTGTCCC 3' 测序引物及序列: GLprimer2: CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA 载体标签: -- 载体抗性: 氨苄 筛选标记: -- 备注: 用于快速定量评估影响哺乳动物细胞特定基因表达的因子及其影响能力。 稳定性: 稳定 组成型: 非组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pGL3--‐Promoter载体质粒图谱和多克隆位点信息
pGL3--‐Promoter载体序列 ORIGIN 1 GGTACCGAGC TCTTACGCGT GCTAGCCCGG GCTCGAGATC TGCGATCTGC ATCTCAATTA 61 GTCAGCAACC ATAGTCCCGC CCCTAACTCC GCCCATCCCG CCCCTAACTC CGCCCAGTTC 121 CGCCCATTCT CCGCCCCATC GCTGACTAAT TTTTTTTATT TATGCAGAGG CCGAGGCCGC 181 CTCGGCCTCT GAGCTATTCC AGAAGTAGTG AGGAGGCTTT TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG
.. 本科学生综合性实验报告 学号 074120267 姓 名 吴永文 学院 生科院 专业、班级 07级应生B 班 实验课程名称 遗传学实验 教师及职称 曹 能 （副 教 授） 开课学期 2008 至 2009 学年 下 学期 填报时间 2009 年 6 月 5 日 云南师范大学教务处编印
一．实验设计方案
二．实验报告
.. 2．对实验现象、实验结果的分析及其结论 ： ⑴、 实验现象（观察结果）： 将制作好的小鼠骨髓细胞微核涂片分别先后置于低、高倍镜下观察、识别小鼠骨髓细胞微核的形态及染色，可观察到其染色呈灰蓝色，嗜多染红细胞中的微核呈紫红色或蓝紫色的较小圆形、边缘光滑的微粒。其图片如下所示： ⑵、 对实验结果的分析： 根据实验所得结果用Excel 进行作图可得如下图象： 各组受试物微核率 5010015020025030035040045012080 40 3 1.5 1 3 2 1 40mg/kg体重 40mg/kg体重 1 2 3 1 2 3 1 2 3 阴性阳性对苯二酚 秋水仙素 氯化汞 对照组 受试物及其剂量（mg/kg） 含微核细胞数 从上图中我们可以看出试验所用的受试物对小鼠的染色体都有一定的损害作用，从而是小鼠骨髓细胞产生微核，且对于同一种受试物其所用剂量越大，则其对应的微核率越高，即微核率的大小与受试物（作用因子）的剂量呈正比。 另外，我们也可以从阴性对照组微核检出率不足0.5％中看出小鼠骨髓细胞中自发的微核率明显低于各组受试物和阳性对照组的结果，这说明在自然条件下小鼠骨髓细胞中同样存在染色体受损的情况，此次实验人为注射的各组受试物的微核率较高，表明它们对染色体的纺锤体或着丝点功能有损害作用的物质，为微核试验阳性物质。
小鼠骨髓间充质干细胞培养 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 实验准备： 1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。 2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器 操作步骤 1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养 取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5?2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每两天换液1次，并观察细胞形态。待细胞长至80%-85%时传代（1传2） 2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速。 采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。 分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs 获得或失去这些表面标记物的表达。
哺乳动物细胞蛋白表达FAQ 1、什么是质粒超螺旋，超螺旋对提高表达量有什么帮助？答：闭环DNA（closed circular DNA）没有断口的双链环状DNA，亦称为超螺旋DNA ，超螺旋比例90%以上是比较理想的真核表达质粒，较低的超螺旋比例会降低表达量近50%以上。 2、CHO细胞与293细胞有什么区别？ 答：CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞，是目前表达外源蛋白最多最成功的细胞之一。该细胞属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，自身很少分泌内源蛋白，因此有利于目的蛋白的纯化分离；相较于其他细胞类型，CHO细胞是治疗性蛋白生产的主要宿主细胞的原因如下：（1）能在化学成分限定和无血清悬浮培养中稳定生长， （2）该细胞基因组信息明确，在人类致病病毒应答方面表现出合理的安全性， （3）能够表达与人相似的翻译后修饰。 此外，CHO细胞表达系统的最重要优势之一是能够容易的得到基因改造的细胞。然而，因为糖基化模式与人类不完全相同，导致CHO细胞产生的重组蛋白在某些时候仍然表现出免疫原性。 HEK293细胞是真核蛋白表达常用的细胞之一，它具有以下优势：更快的生长速度，更高的生长密度、转染效率高，表达后修饰更接近人体蛋白的结构，可能会有潜在的人病毒污染。
3、常用的哺乳动物细胞蛋白表达系统是什么？原理是什 么？ 答：我们常用的系统是2936e细胞配套PTT5(pAZ5)载体 HEK2936E 是在细胞的基因组中整合了EBV病毒的 nuclear antigen 1 (EBNA1), 该蛋白可以保证含有EBV病毒复制原点(EBV ori）的质粒在HEK293E 细胞株中复制，提高质粒的拷贝数，进而提高克隆在此种质粒上的外源基因的表达水平。该系统比常规的293F细胞表达量要高。 4、导致哺乳动物细胞蛋白表达低或者不表达的原因有哪些？哪类蛋白不容易表达？ 答：基因是否优化，有的蛋白稀有密码子较多，需要对应表达细胞进 行优化密码子。 蛋白本身就比较难做，比如细胞因子类的，衣壳蛋白类的，膜蛋白。质粒质量：内毒素水平、有无蛋白和核酸污染、超螺旋比例、无盐苯酚等试剂 分子量较大或者太小：大于150KD表达会有一定的难度，小于5KD也会有难度。 有的表达量不低，但是纯化得率低（可溶性差，不挂住，不稳定，易降解） 难表达蛋白：细胞因子、激素、抗菌肽、衣壳蛋白、膜蛋白
小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化实验前准备： 超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、75cm2细胞培养皿、2mL注射器、无菌40μm尼龙过滤器、细胞吸管、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、红细胞裂解液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、M-CSF因子、细胞计数版、倒置显微镜等。 操作步骤： （1）C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒，固定小鼠。 （2）无菌条件下分离并取下小鼠的股骨和胫骨，小心不要打破骨头。然后放入事先含有75%酒精的75cm2的细胞培养皿中。 （3）移入生物安全柜中，进一步分离去除骨周围组织，然后将其移入含有1×PBS的另一细胞培养皿中清洗，最后再将其转移另一 75cm2细胞培养皿（含有1%双抗的DMEM的细胞培养基）中等待下一步处理。（4）用眼科组织剪去除股骨和胫骨的骨两端，然后含有2ml DMEM 细胞培养基的注射器从骨的一个断端冲洗骨髓细胞到10ml无菌离心管中，重复 3 次。 （5）1500r/min，离心 8min，弃上清液。 （6）加入5ml红细胞裂解液，吸管反复吹打，然后静置 3min。（7）1500r/min，离心 8min，弃上清液。 （8）加入5ml DMEM 细胞培养基重悬细胞，然后用40μm尼龙过滤器过滤细胞。
（9）1500r/min，离心 8min，弃上清液，重复 3 次。 （10）a 加入含有 20%FBS/ DMEM 的细胞培养液重悬细胞，到该步骤提取完毕。b 加入含有 20ng/ml的 M-CSF 的 20%FBS/ DMEM 细胞培养液重悬细胞，诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞。细胞计数，调整细胞浓度至1×106／mL。接种75cm2细胞培养皿中。 （11）放于37℃、5％二氧化碳饱培养箱中培养，待后续实验研究。
重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制 技术评价一般原则 二OO六年十月
目 录 1前言 1 1.1目的和意义 1.2适用范围 1.3局限性 2宿主细胞的选择 1 2.1宿主细胞来源、历史和一般特性 2.1.1宿主细胞来源和历史 2.1.2宿主细胞一般特性 3重组工程细胞克隆构建过程、筛选及鉴定 2 3.1目的基因来源 3.2表达载体的具体构建步骤 3.3载体引入宿主细胞的方法及重组工程细胞的筛选 3.4重组工程细胞的初步鉴定 4重组工程细胞库的建立 3 4.1细胞库建立 4.2建库细胞的管理 5细胞库检定 3 5.1细胞鉴定 5.1.1细胞种属的鉴定 5.1.2致瘤性试验 5.1.3目的基因和表达框架分析 5.1.4表达产物检测 5.2微生物污染检测 5.2.1细菌、真菌和支原体检查 5.2.2病毒因子的检查 5.2.2.1体外试验 5.2.2.2体内试验 5.2.2.3种属特异性病毒的检定
5.2.2.4逆转录病毒的检测 5.2.2.4.1感染性试验 5.2.2.4.2逆转录酶检测 5.2.2.4.3透射电镜检查 6细胞稳定性研究 6 6.1贮存条件下的稳定性 6.2传代/扩增过程中的稳定性 6.2.1基因水平的比较 6.2.2目的产物表达水平的比较 6.2.3细胞自身的稳定性 6.2.4内源因子检查 6.2.5 致瘤性监测 7 生产过程细胞质量控制 7 7.1常规生产过程监控 7.2细胞增殖限度 7.3其它风险性因素控制 8小结 8 9、名词解释 9 10、参考文献 10
1前言 对于结构复杂、带有糖基化修饰基团的抗体、凝血因子、酶、激素等生物大分子，通常需要借助哺乳动物细胞才能正确表达和修饰成具有预期生物活性的重组制品。随着生物工程技术的进步和发展，目前这些细胞应用不断增多。 在宿主细胞选择、重组工程细胞构建以及生产细胞的培养扩增和监控过程中，不仅要关注细胞的适用性、目的产物表达生产能力，同时还应当重视伴随细胞培养产生的内源性病毒、宿主细胞残余蛋白和DNA、致肿瘤成分等潜在的风险性因素对重组产品带来的安全性影响，在早期研究阶段，同步开展库细胞、生产培养过程细胞、生产终末细胞的全面检定和控制以及病毒和/或致瘤性成分的去除/灭活工艺的验证。 1.1目的和意义 经过全面检测的种子细胞是实现重组基因工程产品生产的前提和基础，使生产用种子细胞具有共同的始祖细胞，保持相同的遗传和生物学特征，在特定的培养环境和条件下持续稳定表达携带的外源目的基因；经过研究确定细胞在扩增培养和生产过程中的变化，才能够有效控制风险性因素，满足生产的持续需求，使产品质量保持一致。 本技术评价一般原则重在阐述重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制的基本内容和相关要求，以期引导开展全面完整的细胞质量试验研究、生产细胞培养工艺验证，建立系统规范的重组工程细胞库及实现生产过程细胞质量的有效监控。
哺乳动物红细胞专题知识总结 生物组赵鹏 高中阶段关于红细胞的知识一再出现，尤其是哺乳动物红细胞，历年各省高考题、全国高考题多次以红细胞为知识背景考查学生的能力水平，由此也凸现了红细胞知识的重要性。在此做以总结，望在同仁中起到抛砖引玉的作用。 一、形态与颜色：双凹型结构、红色。如下图： 二、产生：由骨髓中的造血干细胞分裂、分化形成。其分化的示意图如下： 三、基因突变——镰刀型细胞贫血症： 1、病因：造血干细胞分裂分化形成红细胞的过程中还要不断地分裂形成新的干细胞， 若这个过程发生基因突变，则可能诱发镰刀型细胞贫血症。其示意图如下： 2、概述：是一种隐性基因遗传病。患病者的血液红细胞表现为镰刀状，其携带氧的功能只
有正常红细胞的一半。 3、诊断： （1）细胞水平：取血液制装片，光学显微镜观察红细胞的形态； （2）分子水平：利用β—珠蛋白基因做成的探针进行检测。 典型考题： 例、（07江苏高考生物试卷38题）单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。镰刀型细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。已知红细胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者的基因型为bb。有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示意图。 （1）从图中可见，该基因突变是由于________引起的。巧合的是，这个位点的突变使得原来正常基因的限制酶切割位点丢失。正常基因该区域上有3个酶切点，突变基因上只有2个酶切点，经限制酶切割后，凝胶电泳分离酶片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正常基因显示________条，突变基因显示________条。 （2）DNA或RNA分子探针要用________等标记。利用核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷酸序列（---ACGTGTT---），写出作为探针的核糖核苷酸序列________。 （3）根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿是否会患有镰刀型细胞贫血症。这对夫妇4次妊娠有胎儿Ⅱ-1～Ⅱ－４中基因型BB个体是____________，Bb的个体是________，bb的个体是_______________。 评析：展示本题的目的不仅在于让学生巩固复习利用探针来诊断疾病的方法，同时让学生了解整个过程的梗概，因为近些年高考题中，有关电泳的考题并不少见，可藉此机会向学生简述。 答案：(1)碱基对改变(或A变成T) 2 1 (2)放射性同位素(或荧光分子等) …UGCACAA…(3)Ⅱ一l和Ⅱ一4 Ⅱ一3 Ⅱ一2 4、治疗：骨髓移植，即向患者移植正常人的造血干细胞。 ○1骨髓库：骨髓库并不是把供者的骨髓或造血干细胞存到库里。骨髓库里保存的只是志愿捐献造血干细胞人们的名字、年龄、性别、健康状况、详细地址、HLA基因检查结果等。如果有一个患者需要做造血干细胞移植，患者的HLA基因与所有志愿者的HLA基因进行配对，配对相合，便通知该志愿者捐献造血干细胞。因此骨髓库参加的志愿者越多，库容量越大，患者找到相合捐献者的机会就越多。 ○2属于器官移植，会产生排斥反应；
生态工程学院 遗传学设计性实验报告 题目：黄豆根尖微核技术系别：生态工程学院 专业班级：生物科学2012级 组员姓名：孟迎、罗廷、何忠平 蔡国宪、丁琴 姓名：罗廷 学号：28111201029 指导教师：蹇黎 完成时间： 2015 年 6月11日
黄豆根尖微核实验报告 一、实验目的 1、了解环境诱变物对微核产生的原理。 2、掌握微核试验技术。 3、了解毒理遗传学在环境监测中的应用及意义 二、实验原理 微核简称(MCN)，是真核生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生。微核是无着丝点的染色体断片，在有丝分裂后期由于不能向两极移动而游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，可在它附近看到若干个圆形的结构，游离于主核之外直径大约是细胞直径的1/20到1/5，这就是微核。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，但有些实验也证明整条的染色体或多条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块。已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。所以可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。 由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们需要有一套高度灵敏、技术简单的测试系统来监视环境的变化。微核产生的概率可与诱变因子的剂量成正比，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。 随着经济发展、经济总量增加，废水排放总量增长迅速，污染物排放总量超过水环境容量，尤其在一些人口密集、企业密布或重污染企业分布较多的区域。水质恶化问题已经比较突出；饮用水水源地有机污染日渐严重，饮用水安全问题已经显现，人民群众生产、生活受到影响。利用毕节市流仓河道河水以黄豆萌发的芽作为实验材料进行微核测试，一方面可准确的显示各种处理诱发植物畸变的效果，另一方面可用于当今发展地区对河道污染程度的间接反应和监测。
哺乳动物细胞表达系统 按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。本文主要从表达系统及其两个组成部分——表达载体和宿主细胞等方面，简要介绍哺乳动物细胞表达系统和相关的研究进展。 研究现状 ①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。 ②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。有些产品已投入临床应用或试用。 ③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/l08细胞/24小时。有人认为其限速步骤可嚣是在工程细胞中(对于重组蛋白来讲，常是异源的)，重组蛋白的分泌效率较低。 1 表达载体 1．1 表达栽体的类型 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。 根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视，这是因为它与其它病毒载体相比有特有优势，如可通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒；可感染多种哺乳动物细胞，但在细胞内无复制能力，生物安全度高；可插入高达38 kb的外源基因等。 质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在，如SV40病毒载体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。利用Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒载体感染哺乳动物细胞表达的蛋白在结构与功能上与天然哺乳动物来源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒载体感染哺乳动物细胞获得的外源蛋白占细胞总蛋白的；而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的问题，但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。 附加体型载体在胞内的复制需要两种病毒成分：病毒DNA的复制起始点(ori)及复制相关蛋白。根据病毒成分的来源不同，附加体型表达载体主要分为4大类，表2对这几类附加体载体进行了简要的概括。 载体的选择取决于外源基因的导人方式和其调控元件是否有利于转录和翻译。真核
小鼠骨髓微核试验
小鼠骨髓细胞微核试验 一、目的与要求 1. 熟悉微核的概念、微核的来源、体内微核试验的实验设计、微核试验检测的遗传学终点。 2. 学习和掌握小鼠骨髓细胞微核试验基本方法步骤，嗜多染红细胞及微核细胞镜下观察。 3. 了解微核试验数据整理、分析方法及结果的评价。 二、实验原理 微核与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。 无论是断片还是整条染色体，其实质都是遗传物质，一但发生畸变，就有能形成遗传物质方面的问题，造成突变，因此，微核的检测实质上就是遗传物质突变的检测，现已被卫生部定为外来化合物毒理检测的—个必检指标。 微核试验是观察受试物能否产生微核的试验。主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。 传统的微核试验是体内试验，它观察骨髓嗜多染红细胞（PCE）中的微核。微核可位于多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区分，所以只有在无核的红细胞中才易辨认。在骨髓中无核的红细胞有嗜多染红细胞或称晚幼红细胞（呈灰蓝或浅蓝色）和成熟红细胞（呈粉红或桔红色）两种，正常情况下嗜多染红细胞占多数，所以观察骨髓嗜多染红细胞。PCE指在红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时将主核排出而微核仍保留在细胞质中的细胞，
但由于嗜多染红细胞的胞质内含有核糖体，因此Giemsa染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡橘红色，使嗜多染红细胞在染色上与正常RBC （NCE）有所不同。微核可以由染色体诱裂剂导致的染色体无着丝粒片段所构成，也可以由非整倍体诱发剂所导致的落后染色体形成。 三、实验设计 1. 动物选择：常用小鼠，体重18~20 g，7~12周龄，每组10只，雌雄各半。 2. 染毒途径：原则上与人接触化学毒物相同或相近的途径。 3. 染毒次数及取样时间：一般采用两次染毒或多次染毒。两次染毒：第1次染毒后24小时进行第2次染毒，6小时后取样；多次染毒：每天染毒1次，连续染毒5天，末次染毒后24小时取样。 4. 剂量选择：至少设置3个剂量组。高剂量组应达到不产生动物死亡的最大毒作用剂量。一般取受试样品1/5、1/10、1/20 LD50剂量。当受试样品的LD50大于5 g/kg时，可取5 g/kg为最高剂量，以下设3~5个剂量组。另设溶剂对照组（阴性对照组）和阳性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺（50~100 mg/kg）或丝裂霉素C（10 mg/kg）腹腔注射1次。 四、操作步骤 1. 骨髓液的制备及涂片 颈椎脱臼处死小鼠，取胸骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去骨骺，将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片一端，另取一块边缘整齐的载玻片，在血清上轻轻按摩，使骨髓完全混匀，然后以45~50度角快速推片，推片后在空气中晾干。 2. 固定 将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15分钟，晾干。
细胞株名称ATCC 编号细胞来源细胞种类生长状态使用培养基 293 CRL-1573 人胎肾贴壁、上皮样MEM/NEAA,10%FBS 2215 无人肝癌贴壁、上皮样DMEM,15%FBS 127TAg CRL-2817 小鼠多能胚胎干细胞胚胎型DMEM, 10% FBS 293/CHE-Fc CRL-2368 人肾上皮细胞、贴壁DMEM,10%FBS 3T3-L1 CL-173 小鼠胚胎成纤维成纤维DMEM,10%FBS 3T6 CCL-96 小鼠胚胎成纤维细胞、贴壁DMEM,10%FBS A431 CRL-1555 人表皮细胞癌上皮细胞、贴壁DMEM,10%FBS A549 CCL-185 人肺癌贴壁、上皮样F12,10%FBS A9 CRL-6319 小鼠结缔组织成纤维细胞、贴壁DMEM,10% FBS+ AR42J CRL-1492 大鼠胰腺肿瘤贴壁、上皮样Ham'sF-12K, 20%FBS AtT-20 CCL-89 小鼠垂体肿瘤上皮细胞、贴壁F-10, 15% HS和2.5% FBS B95-8 CRL-2311 绒猴EB病毒感染的白血病细胞成淋样RPMI-1640, 10% FBS BALB/3T3 CCL-163 小鼠胚胎成纤维细胞、贴壁DMEM, 10% FBS bel7402 无人肝癌贴壁、上皮样RPMI-1640,15%FBS BeWo CCL-98 人绒毛癌上皮细胞、贴壁F-12K, 15%F12 BHK-21 CCL-10 仓鼠肾成纤维细胞、贴壁MEM/NEAA, 10% FBS BHL-100 无人乳房上皮细胞、贴壁McCoy'5A, 10% FBS BRL 3A CRL-1442 大鼠肝上皮细胞、贴壁MEM/NEAA, 10% FBS BT CRL-1390 牛鼻甲骨细胞成纤维细胞、贴壁DMEM, 10% FBS Caco-2 HTB-37 人结肠腺癌上皮细胞、贴壁MEM/NEAA, 10% FBS Chang 无人肝脏上皮细胞、贴壁BME, 10% FCS
哺乳动物细胞培养基的基本要求 (一)营养成分 细胞生长繁殖所需要的营养成分包括氨基酸、单糖、维生素、无机离子和H 2 O。 氨基酸和维生素的添加量是有限的，某些氨基酸和维生素的添加量往往是凭经验的，通常与某个细胞系的建立过程有密切关系。例如，Fisher’s培养基含有高浓度的叶酸，这是因为L5178Y对叶酸的依赖性，在这种培养基的发展过程中，叶酸就被沿用下来了。 大多数细胞的培养基都含有葡萄糖作为能量来源，葡萄糖的主要代谢途径是通过无氧酵解产生丙酮酸，丙酮酸可转化为乳酸盐或乙酰乙酸盐，然后进入柠檬 酸循环被氧化成CO 2和H 2 0。培养基中乳酸的累积在培养胚胎及转化细胞时尤为 明显，提示体外培养时柠檬酸循环不能像多细胞机体内那样完全进行。有证据表明，碳源的大部分来自谷氨酰胺而非葡萄糖。这也解释了为何某些培养的细胞对谷氨酰胺和谷氨酸盐的需求异常高。 (二)促生长因子及激素 促生长因子及激素在商品干粉培养基或液体培养基中一般都不添加，含血清培养液的来源正是血清本身。在无血清培养基中+经常需要添加这些组分。 自然凝集的血清，与利用物理方法如离心法去除细胞得到的血浆相比，对于刺激细胞的增殖，效果更好。原因是，自然凝集的血清保留了更多的生长因子，如血小板生长因子。 (三)渗透压和pH 培养基中基础平衡盐溶液组成的盐类是维持渗透压平衡的主要化合物，这些 盐类主要包括Na一、K+、Mg2+、Cl一、SO 42-、Ca2+、POi 和HCO 3 -等。 大部分培养基的盐浓度是依据Eargle’s和Hank’s平衡盐溶液而来， Eargle’s平衡盐溶液的Hank，s浓度高，适合5％CO 2 的气体环境。Hank’s平 衡盐溶液的HCO 3 -浓度低，适 用于空气环境。5％CO 2 的气体环境中，培养液的pH稳定及调节依赖于溶解在培 养液的CO 2 气体和组成培养基基础平衡盐溶液的缓冲作用。
精品文档 精品文档哺乳动物成熟红细胞的呼吸方式 哺乳动物的成熟红细胞结构很特殊，既没有细胞核也无线粒体、核糖体等各种细胞器，却富含血红蛋白，这种结构特点与其运输O2的功能是相适应的。 因为无线粒体，红细胞进行无氧呼吸供能。有些学生对此产生疑问：红细胞本身携带O2，却进行无氧呼吸供能，有O2存在时，其无氧呼吸不会受抑制吗？并列举如下理由：①很多种厌氧型的细菌若生活在空气中，其无氧呼吸受到抑制，不能正常生存。②酵母菌等兼性厌氧型的生物生活在氧气充足的环境中进行有氧呼吸，在缺氧的条件下才进行无氧呼吸。 首先明确并不是所有厌氧型的生物都不能生活在有氧环境中，只有那些严格厌氧菌才不能生活在空气中（如光合细菌，产甲烷杆菌等），而耐氧性厌氧菌是可以生活在空气中的。厌氧菌能否生活在空气中，与其体内是否含有超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（或过氧化物酶）有关。细胞代谢过程中会产生自由基，自由基是指那些带有奇数电子数的化学物质，它们都带有未配对的自由电子，具有高度的化学活性。在O2存在时还会产生超氧阴离子自由基，它是活性氧的形式之一，性质极不稳定，化学反应能力极强，在细胞内可破坏各种重要生物大分子和膜结构，还可形成其他活性氧化物，故对生物体极其有害。好氧性生物或耐氧性厌氧菌细胞内可合成SOD和过氧化氢酶（或过氧化物酶），超氧阴离子自由基在SOD作用下被歧化成H2O2，在过氧化氢酶作用下H2O2又进一步转变成无毒的H2O，而严格厌氧菌不能合成SOD，在有O2存在时，由于无法歧化超氧阴离子自由基而身受毒害，无法生存。 红细胞内存在这两种酶（红细胞未成熟前已合成），生活在有氧环境中，不会受自由基的危害而抑制其代谢活动。 酵母菌等兼性厌氧型的生物，在缺氧的条件下进行无氧呼吸，当氧气充足时进行有氧呼吸，其无氧呼吸将会受到抑制。为什么在O2充足时，酵母菌的无氧呼吸会受到抑制呢？已知磷酸果糖激酶是无氧呼吸（糖酵解）过程中关键的限速酶，ATP对磷酸果糖激酶具有抑制作用，在有柠檬酸、脂肪酸时会加强抑制效应，而ADP、AMP、无机磷则对此酶有激活作用，酵母菌有氧呼吸会产生较多的ATP，使ATP/ADP比值增高，无机磷相对减少，有氧呼吸过程中还会使柠檬酸等物质增多，最终抑制了磷酸果糖激酶的活性，同时NADH进入线粒体中被有氧呼吸消耗，不能还原乙醛生成乙醇，还会使糖酵解过程中的NAD和NADH不能发生周转，也影响了糖酵解速度。 由以上可知，抑制无氧呼吸的直接原因，是生物细胞进行了有氧呼吸，在有氧呼吸的过程中发生的物质变化抑制了无氧呼吸的进行，并不是由于O2的存在直接抑制了无氧呼吸。成熟的红细胞内由于缺乏有氧呼吸酶系，不能进行有氧呼吸，所以红细胞尽管携带较多的O2也不会抑制其无氧呼吸。 红细胞进行无氧呼吸是与其运输O 2的功能相适应的，因其结合和携带O 2 的过 程中并不消耗O 2，从而有效地提高了运输O 2 的效率。红细胞自身生命活动所消 耗能量并不多，其无氧呼吸产生能量主要是保证细胞膜上离子泵的正常运转，使红细胞维持细胞内高钾、低钙和低钠的状态，还能保证低铁血红蛋白不被氧化。（若血红蛋白中的Fe2＋被氧化为Fe3+，形成高铁血红蛋白，高铁血红蛋白中的Fe3+
小鼠骨髓细胞微核试验 一、目的与要求 1. 熟悉微核的概念、微核的来源、体内微核试验的实验设计、微核试验检测的遗传学终点。 2. 学习和掌握小鼠骨髓细胞微核试验基本方法步骤，嗜多染红细胞及微核细胞镜下观察。 3. 了解微核试验数据整理、分析方法及结果的评价。 二、实验原理 微核与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。 无论是断片还是整条染色体，其实质都是遗传物质，一但发生畸变，就有能形成遗传物质方面的问题，造成突变，因此，微核的检测实质上就是遗传物质突变的检测，现已被卫生部定为外来化合物毒理检测的—个必检指标。 微核试验是观察受试物能否产生微核的试验。主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。 传统的微核试验是体内试验，它观察骨髓嗜多染红细胞（PCE）中的微核。微核可位于多种细胞，但在有核细胞中难与正常核的分叶及核突出物区分，所以只有在无核的红细胞中才易辨认。在骨髓中无核的红细胞有嗜多染红细胞或称晚幼红细胞（呈灰蓝或浅蓝色）和成熟红细胞（呈粉红或桔红色）两种，正常情况下嗜多染红细胞占多数，所以观察骨髓嗜多染红细胞。PCE指在红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时将主核排出而微核仍保留在细胞质中的细胞，但由于嗜多染红细胞的胞质内含有核糖体，因此Giemsa染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡橘红色，使嗜多染红细胞在染色上与正常RBC（NCE）有所不同。微核可以由染色体诱裂剂导致的染色体无着丝粒片段所构成，也可以由非整倍体诱发剂所导致的落后染色体形成。 三、实验设计 1. 动物选择：常用小鼠，体重18~20 g，7~12周龄，每组10只，雌雄各半。 2. 染毒途径：原则上与人接触化学毒物相同或相近的途径。