革兰氏染色说明

实验四、革兰氏染色

革兰氏染色是一种常用于细菌分类和鉴定的染色方法。该方法分为革兰氏阳性染色和革兰氏阴性染色两种。革兰氏染色的原理是根据细菌细胞壁的结构差异来进行染色。革兰氏阳性菌细胞壁主要由厚的层状胞壁和内层的细胞质膜构成，可以被革兰氏染色液染成紫色。而革兰氏阴性菌细胞壁由较薄的胞壁和外层的膜双层构成，不能被革兰氏染色液染色，需加上其他染色剂才可以被显色。

革兰氏染色方法的操作步骤如下：

1.准备好需要染色的细菌培养物，一般建议使用18-24小时老化充分的培养物。

2.将菌液滴于玻片上，覆盖薄片后在空气中晾干。

3.用火将玻片送入火焰中进行加温灭菌，使菌落固定于玻片上。注意火力不要太大，以免将菌落烧焦。

4.将玻片放入革兰氏染色液中，静置1分钟。

5.用蒸馏水冲洗玻片，使多余的染色液流失。

6.加上碘液，静置1分钟。

8.将玻片放入96%乙醇或酒精醋酸液中，静置数秒钟至10秒钟。

10.将玻片放入甲苯中干燥。

11.观察染色结果，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

革兰氏染色适用于大多数细菌的分类和鉴定。通过观察菌落的形态、大小、色泽、透明度、光泽等特征，再结合革兰氏染色的结果，可以对细菌进行初步鉴定。革兰氏染色还可以用于临床检测，如分离出的尿液、呕吐物、血液等可通过革兰氏染色结果初步判断细菌是否存在。

革兰氏染色对于细菌形态学和生理学的研究具有重要意义，但也有一些缺点。例如，一些细菌在革兰氏染色中难以区分其是否为革兰氏阴性菌，此时需要结合其他的鉴定方法进行辅助鉴定。此外，革兰氏染色只能在细菌培养物中进行，无法对非细菌生物或生长周期长的菌种进行染色。此时需要采用其他的染色方法或者细胞学技术。

总之，革兰氏染色是一种方便、简单、易于操作的染色方法，是细菌形态学研究和临床检测的常用方法之一。

实验二 细菌的革兰氏染色法

一、目的要求

1. 掌握革兰氏染色的方法及原理。

2. 进一步熟悉显微镜的使用

二、基本原理

1. 革兰氏染色的意义：

革兰氏染色的反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医生Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示。

2. 革兰氏染色的原理：

细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

三、器材

大肠杆菌，金黄色葡萄球菌12～20h斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。

四、操作步骤

1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。

载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。

2. 干燥 室温自然干燥。

3. 固定 固定时通过火焰2～3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。

热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。

4. 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约1～2min，水洗。

5. 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。

革兰氏染色法

革兰氏染色法(Gram's stain)是最常用的细菌染色法，本实验要求同学能正确掌握此染色方法的操作技术，理解其在鉴别细菌上的重要意义。

【原理】

细菌经结晶紫初染染成蓝色。革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。

【材料】

【方法】

按涂片→干燥→固定→染色→镜检的顺序进行。准备载物玻片：用镊子从载物片缸中取出经3％盐酸酒精脱脂的载物玻片，用擦片布擦净，然后用特种铅笔在玻片背面画一个直径为1.5~2.0cm的圆圈，做为涂膜的标记范围。1．涂片：按无菌操作取材法进行，具体步骤如下：

用肉汤培养物涂片：

①右手拿接种环的黑色塑料柄部分，左手托持试管。

②将接种环按15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌，直到把金属丝

烧红(图1-2)，然后将铝制的银色柄部也通过火焰略加烧灼。

③用右手小指和手掌的前内缘拔掉左手所持试管的棉塞，并立即将

试管口用火焰烧灼灭菌。

④用灭菌后已冷却的接种环伸入试管中取出材料(图1-3)，此时注

意勿使沾有材料的接种环触碰试管壁及试管口。

⑤将试管口再次灭菌，棉塞也要在火焰上略加烧灼（时间要短以免

点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。 ⑥将接种环上之材料涂于载物片上，随后立即将接种环用火焰烧灼

灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。

用斜面培养物涂片：

用细菌斜面培养物涂片，需预先取一接种环生理盐水放在载物片

上，然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取少量菌苔，在水滴内轻轻研磨将细菌制成菌悬液，再涂成一薄膜。无菌操作取材步骤同前。2．干燥：放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部

革兰染色的原理

革兰染色是一种常用的细菌分类和鉴定方法，它是以丹尼尔·埃德温·革兰（1881-1938）的名字命名的。革兰染色的原理是利用革兰氏染色法对细菌进行染色，根据细菌细胞壁的结构特点来区分细菌的分类。

首先，我们来了解一下革兰氏染色法的步骤。革兰氏染色法是一种区分细菌的染色方法，它包括了紫晶染色、碘液固定、酒精脱色和蓝色染色四个步骤。在进行革兰氏染色时，首先将细菌涂片加上紫晶液，使细菌涂片呈紫色；然后加入碘液固定，使细菌涂片呈蓝黑色；接着用酒精脱色，将细菌涂片中的染色物质去除；最后再加上蓝色染色，使革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈粉红色。

革兰染色的原理主要是利用了细菌细胞壁的特点来进行区分。革兰阳性菌的细胞壁较厚，含有大量的穿过细胞壁的多糖和多肽，这些物质能够与紫晶染料结合，使细菌呈紫色。而革兰阴性菌的细胞壁较薄，含有脂多糖，这些物质不能与紫晶染料结合，因此在酒精脱色后，革兰阴性菌会呈粉红色。

革兰染色的原理还可以通过细菌的形态特征来进行区分。革兰阳性菌在显微镜下呈现为紫色或蓝黑色的颗粒状或条状结构，而革兰阴性菌则呈现为粉红色的圆形或椭圆形结构。

革兰染色的原理在临床诊断和实验室研究中有着重要的应用价值。通过革兰染色，可以快速、简便地区分细菌的分类，为临床诊断提供重要参考依据。同时，革兰染色还可以帮助科研人员对细菌进行初步鉴定，为后续的实验研究提供便利。

总的来说，革兰染色的原理是通过染色方法和细菌细胞壁的特点来进行细菌的分类和鉴定。革兰染色不仅在临床诊断中有着重要的应用，也在科研领域发挥着重要作用。通过了解革兰染色的原理，我们可以更好地理解这一方法的应用和意义。