实验三细菌革兰氏染色法
【目的要求】了解革兰氏染色原理；掌握革兰氏染色的方法。
【基本原理】
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884 年由丹麦医师Gram 创立。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）
两种类型，细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏染色的主要步骤包括初染、媒染、脱色和复染。首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色。而在最后用复染步骤（染色剂为番红），染色后变为复染剂颜色（红）。
【实验器材】
1.革兰氏染色液：
①草酸铵结晶紫
甲液：结晶紫（2 g）、乙醇（95%）（20 mL）;
乙液：草酸铵（0.8 g）、蒸馏水（0.8 mL）;
将甲、乙两液混合，静置48h 后使用，该染液稳定，在不透气的棕色瓶中可存储数月。
②卢戈氏碘液
碘（1 g）；碘化钾（2 g）；蒸馏水（300 mL）
先将KI溶于少量（3-5 mL）蒸馏水中，再放入碘，待碘全溶后，加水至300 mL。
此液稳定，可在不透气的棕色瓶中保存数月。
③脱色液：95%乙醇
④复染液：即2.5%蕃红（沙黄）水溶液。
沙黄（2.5 g）; 95%的酒精（10 mL）；蒸馏水（90 mL）
将沙黄溶于乙醇中，再用蒸馏水稀释。
2.显微镜、灭菌玻片、灭菌牙签、酒精灯、擦镜纸、计时器。
【操作步骤】
1涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，从平板上挑取待观测菌落于在载玻片的中央，用滴
管滴取蒸馏水一滴，用灭菌后的牙签将菌落与液滴混合物涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。
2干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
3固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3 次，共约2-3 秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60C）,放置待冷后，进行染色。
4初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2 滴，使染色液覆盖涂片，染色约
1min 。
5水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
6媒染：用100-1000』移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
7水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
8脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30s，随即水洗。
9复染：在涂片薄膜上滴加蕃红染液1-2 滴，使染色液覆盖涂片，染色约1-2 min。
10水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
11干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物
后滴一滴浸油在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的
是革兰氏阴性菌。
【实验结果】
1.绘出油镜下观察的混合区菌体图像。注意标明革兰氏染色结果（紫或红），并判定所挑取菌落的革兰氏阴阳性。
2.观测单个细菌形状。
【思考题】
1.革兰氏染色时需要注意哪些问题，为什么？
2.你认为革兰氏染色法中哪个步骤可以省略？在何种情况下可以省略？
