小鼠窦前卵泡的最佳共培养方法探讨
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小鼠胚胎干细胞
胞培养的标准操作规程传代。通常把首次接种到
较大面积的细胞记为第一代。
1.5 ES细胞的传代培养
不要等到细胞铺满使培养基极度酸化时再传代；要
避免继续分裂的细胞死于极度拥挤和营养耗竭。
传代可望收获3×105个细胞/cm2，再以2×104个
/cm2的密度接种。规律更换培养基，大约3天左右
传一次代。
3.4 酶活测定
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP)是一 类单酯磷酸水解酶，通常在囊胚ICM及其衍 生的ES细胞也表现较高AP活性，而ES细胞 发生分化后， AP活性随之降低。 因此，尽管AP不是多潜能性细胞特异表达 ，但AP活性检测仍广泛用于确定这些细胞 是否处于未分化状态的标志之一。
有人提出使用交替使用胎牛血清和血清替代
物的解决方案，可以达到75%的成功率（一 般是25%）。
集落形成试验检测培养条件
在6孔板中加入待测培养基（2ml/孔），添 加物为终浓度的两倍；如果检测血清，则 需要设置5%、10%和20%三种浓度。 ES细胞半铺满时，通过胰酶消化，最终用 无血清培养基分散ES细胞成单细胞悬液， 以103个/ml的密度重悬于生长培养基。 每孔加入2ml细胞悬液，使添加物在4ml终 体积中为1×，正常培养6-8天。
病原体检查不但有利于将来使用这些ES细 胞生成不含特殊病原体SPF动物，而且还有 利于避免将病原体传染给其他细胞培养物。 最常见的病原体是支原体。
3.3 核型分析
核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型，包括染色
体数目、大小、形态特征等。
核型分析是指在对染色体进行测量计算的基础上，进
行分组、排队、配对并进行形态分析的过程。核型分
1动物胚胎工程实验教程小鼠卵的体外成熟与体外受精材料与方法
《动物胚胎工程实验教程》王子玉自编南京农业大学动科院2005年8月实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验一、实验目的熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点；掌握小鼠的超数排卵方案；掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。
二、实验器材和材料1. 器材及药品体视显微镜，手术器械（眼科剪，眼科镊），1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔。
操作液（M2），成熟培养液（M－199），激素（PMSG和HCG），石蜡油。
2．实验动物：3-4周龄昆明系雌性小白鼠，自由采食饮水。
三、实验内容1.小鼠的超数排卵注射剂量皮下或腹腔注射PMSG 10 IU/只小鼠。
注射方法皮下注射：用手指捏住小鼠的头及尾部固定（图1-1），以酒精棉球消毒其背部，提起皮肤，将注射针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时，再注入药物。
随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位。
皮下注射时防止药液从针孔处逸出。
腹腔注射：针头刚进入腹腔后向上挑，防止损伤小鼠腹腔内器官。
注射针头宜选用小号细针头。
注射药物后的小鼠自由饮水、采饲，自然光照。
2.卵巢的采集方法在注射PMSG后46h利用颈椎脱臼法处死小鼠（将供体鼠置于饲养笼上，鼠爪自然抓紧笼上铁支架，此时一只手拉紧鼠尾，另一只手食指与拇指压紧鼠颈部，或用镊子压紧颈部即可致死，此为引颈法。
用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬）。
将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感到颈椎部位脱臼的振动；也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。
然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上。
图1－1 小鼠的固定将处死并固定好的小鼠，在下腹部中间剪开1个小口，一只手抓住鼠尾，另一只手抓住切开的皮肤向头部牵拉直至充分暴露腹部（图1-2）。
剪开腹膜，向前方揭去肠胃内脏，即暴露出生殖器官，可在肾脏后方看到两侧呈乳白色的卵巢及与输尿管相平行的两子宫角（图1-3）。
小鼠胚胎获得实验报告
一、实验目的1. 掌握小鼠胚胎的采集方法。
2. 了解小鼠胚胎的发育过程。
3. 培养实验操作技能。
二、实验原理小鼠胚胎的获得是通过人工操作，将雌鼠的受精卵取出，进行体外培养，直至发育成胚胎。
该实验旨在研究小鼠胚胎的发育过程，为后续的胚胎移植、基因编辑等研究提供基础。
三、实验材料1. 实验动物：雌性小鼠、雄性小鼠2. 实验仪器：显微镜、解剖显微镜、培养箱、离心机、培养皿、手术器械等3. 实验试剂：生理盐水、DEPC水、培养液、抗凝剂、消毒剂等四、实验步骤1. 实验动物处理（1）将雌性小鼠和雄性小鼠分别饲养于清洁、通风的动物房中，保持适宜的饲养条件。
（2）雌性小鼠和雄性小鼠分别进行交配，交配后观察雌性小鼠的阴道涂片，确认受精情况。
2. 胚胎采集（1）雌性小鼠交配后第2天，用解剖显微镜观察雌性小鼠的阴道涂片，确认受精情况。
（2）雌性小鼠交配后第3天，将雌性小鼠麻醉，固定于解剖显微镜下。
（3）用手术器械取出雌性小鼠的子宫，置于培养皿中。
（4）在解剖显微镜下，用镊子取出受精卵，置于培养皿中。
3. 胚胎培养（1）将受精卵放入培养箱中，在37℃、5%CO2、95%空气的条件下培养。
（2）观察受精卵的发育过程，记录胚胎的形态变化。
4. 实验结果分析（1）观察胚胎的发育过程，记录胚胎的形态变化。
（2）分析胚胎发育过程中各阶段的形态特征。
五、实验结果1. 胚胎发育过程（1）受精卵在培养箱中培养24小时后，可见胚胎开始分裂。
（2）培养24小时后，胚胎发育至桑椹胚阶段。
（3）培养48小时后，胚胎发育至囊胚阶段。
（4）培养72小时后，胚胎发育至原肠胚阶段。
2. 胚胎形态特征（1）受精卵：透明、圆形，直径约100μm。
（2）桑椹胚：细胞数目增多，排列紧密，形成桑椹状。
（3）囊胚：细胞分化明显，形成囊胚腔。
（4）原肠胚：细胞分化更加明显，形成原肠。
六、实验结论1. 通过人工操作，成功获得小鼠胚胎。
2. 小鼠胚胎在体外培养过程中，经历了受精卵、桑椹胚、囊胚、原肠胚等阶段。
小鼠早期胚胎发育的研究 )
小鼠早期胚胎发育的研究（实验方案）基础生物学课程设计所在学院生物科学与工程学院专业班级生物科学学生姓名学生学号指导教师XXXX年XX月XX日小鼠早期胚胎发育的研究一、引言胚胎发育一词通常是指从受精卵起到胚胎出离卵膜的一段过程。
而无脊椎动物胚胎学家则常把其概念扩展到胎后发育直到性成熟，甚至整个生活史。
动物胚胎的发育过程虽然动物的种类繁多，但是胚胎的发育依然拥有相似的过程，能够分成受精、卵裂、桑葚胚、囊胚、原肠胚与器官形成等阶段。
此外脊椎动物的胚胎发育过程中，各种动物共同拥有的特征会首先出现(如皮肤)，之后才逐渐发展出特化的构造(如鱼鳞)，而且较复杂的物种与较原始的物种之间一开始相当类似，之后才随着发育的时间而慢慢增加变异。
受精:卵子和精子融合为一个合子的过程。
它是有性生殖的基本特征，普遍存在于动植物界，卵裂:精子与卵子结合之后会形成受精卵，由于卵黄的分布具有不对称的特性，因此受精卵可以分为动物极(会发展成外胚层)和植物极(会发展成中胚层与内胚层)。
在卵裂时期，卵子会先分裂成两个细胞，之后细胞通常会逐次倍增，但是对哺乳类而言，有时候会有不同时分裂并造成只有奇数个细胞的现象。
在这个阶段，胚胎的总体积大致不变。
不同的物种具有不同的卵裂方式，可以分为完全卵裂(holoblastic cleavege)和不完全卵裂(meroblastic cleavage)，分别又可以细分成许多不同方式。
如无脊椎动物的辐射卵裂与螺旋卵裂、哺乳动物的旋转式分裂等。
原肠胚:当细胞分裂成为囊胚之后，会经过一段称为原肠形成的型态发生过程，之后形成原肠胚。
原肠形成过程有许多不同方式，能够大致分成5种:内陷式(Invagination)、衰退式(Involution)、进入式(Ingression)、脱层式(Delamination)、包覆式(Epiboly)，动物的胚胎利用这5种方式形成了外胚层、中胚层与内胚层的组合，而这三种胚层在之后会形成各种细胞。
小鼠ivf
体外受精（IVF）实验步骤
1.实验前日准备体外受精用培养皿
精子游离以及定量用培养皿：35mm 培养皿中加入2个200μL TYH培养基液滴
*先加入50μL TYH培养基液滴，覆盖上矿物油后再加入150μL TYH 培养基液滴
体外受精用培养皿：35mm培养皿中加入两个50μL TYH培养基液滴以及两个200μL液滴
2.实验当日，处死雄小鼠一只，将附睾中的精子放入准备好的精子
游离用培养皿。
*用镊子将精子取出后直接放入一个盛有200μL TYH的液滴中。
3.让精子游离获能。
*在游离一个半小时后，进行精子浓度统计。
将5μL 精子悬浊液和45μL 3% NaCl混合，取适量在血球计数器中测定浓度。
为了保证此时的浓度维持在2×106个/毫升，将相邻的一个200μL TYH液滴中，取出相应的培养基，加入等量的精子悬液。
4.让稀释以后的精子继续游离，直至2个小时。
5.处死经过超排处理的雌鼠，分离卵管，放入装有矿物油的培养皿。
6. 用镊子取出卵丘细胞团，直接放入体外受精用培养皿中的200μL TYH培养基中。
*每个液滴内放2-3只小鼠的卵丘细胞团。
7. 用微量注射枪吸取10μL稀释后的精子悬液放入卵丘细胞团的TYH培养基中。
*此时精子的最终浓度约105个/毫升.
8. 体外受精持续4-6个小时。
9. 用吹管将完成体外受精的卵子分离，在50μL的TYH液滴中吹打洗净。
10. 移入约半小时前准备好的CZB液滴中，镜检，出去未受精卵以及只有一个前核的孤雌发育胚胎，统计体外受精百分比。
小鼠日常培养实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解小鼠的生物学特性及其对实验环境的要求。
2. 掌握小鼠的饲养管理方法，包括饲料、饮水、笼具、环境控制等。
3. 观察小鼠的生长发育状况，确保实验动物的健康和繁殖能力。
4. 学习实验动物饲养过程中的常见问题及处理方法。
二、实验原理小鼠作为实验动物，其饲养环境和管理条件对实验结果的准确性具有重要影响。
本实验旨在通过模拟实验室条件，对小鼠进行日常培养，观察其生长状况，确保实验动物的健康和繁殖能力。
三、实验材料1. 实验动物：清洁级昆明小鼠。
2. 实验笼具：金属网笼、塑料笼具、塑料饮水器、塑料食盆。
3. 饲料：颗粒饲料、维生素、矿物质添加剂。
4. 饮水：去离子水或蒸馏水。
5. 环境控制：温湿度控制器、紫外线消毒器。
四、实验方法1. 笼具准备：选用金属网笼和塑料笼具，笼底铺设吸水垫，确保笼内干燥。
2. 饲料准备：将颗粒饲料放入塑料食盆，添加适量维生素和矿物质添加剂。
3. 饮水准备：使用塑料饮水器，保证小鼠随时可以饮用去离子水或蒸馏水。
4. 环境控制：将实验笼具放置在温湿度控制室内，保持室温20～26℃，相对湿度50%～60%。
5. 紫外线消毒：定期使用紫外线消毒器对笼具、饮水器、食盆等进行消毒，防止病原微生物滋生。
6. 观察记录：每天观察小鼠的生长发育状况，包括体重、毛色、食欲、活动等，并做好记录。
五、实验结果与分析1. 小鼠生长发育状况：实验过程中，小鼠生长状况良好，体重逐渐增加，毛色光亮，食欲旺盛，活动自如。
2. 繁殖能力：在适宜的饲养条件下，小鼠繁殖能力较强，雌鼠平均产仔数在8～12只。
3. 常见问题及处理方法：- 食欲不振：检查饲料是否变质，及时更换新鲜饲料；调整饲料种类，满足小鼠营养需求。
- 腹泻：检查饮水是否清洁，及时更换；调整饲料成分，避免过量摄入脂肪和蛋白质。
- 皮肤病变：检查笼具是否清洁，及时更换笼垫；定期使用紫外线消毒器对笼具进行消毒。
- 呼吸道疾病：保持室内空气流通，避免过度拥挤；定期对笼具和饮水器进行消毒。
毓麟珠对早发性卵巢功能不全模型小鼠卵巢形态、卵泡发育及mTOR信号通路的影响
毓麟珠对早发性卵巢功能不全模型小鼠卵巢形态、卵泡发育及mTOR信号通路的影响目的觀察毓麟珠对早发性卵巢功能不全（POI）小鼠卵巢功能、卵泡发育及mTOR通路的影响，探讨其作用机制。
方法以小鼠透明带3（Zp3）为抗原，皮下多点注射BALB/c雌性小鼠建立免疫性POI模型。
实验分为空白组、模型组、阳性药组和毓麟珠低、中、高剂量，各给药组给予相应药物。
HE染色观察小鼠卵巢形态及卵泡，ELISA检测小鼠血清激素水平，Western blot检测卵巢组织AKT、mTOR的蛋白表达，PCR检测mTOR下游相关Rheb、S6k1、4E-BP1的mRNA表达。
结果与空白组比较，模型组小鼠卵巢明显缩小，卵泡数量明显减少，血清促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）明显升高，抗苗勒氏管激素（AMH）、雌二醇（E2）明显下降，Rheb、S6k1、4E-BP1 mRNA和AKT、mTOR蛋白相对表达量明显降低（P＜/em>P＜/em>P＜/em>P＜/em>P＜/em>P＜/em>标签：毓麟珠;早发性卵巢功能不全;卵泡发育;mTOR;小鼠早发性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）是指卵巢功能不全所导致的40岁之前卵巢活动衰退的临床综合征。
特点是月经紊乱伴随血促性腺激素浓度升高和雌激素浓度降低，包含卵巢内卵泡功能障碍或原始卵泡耗竭两个过程[1]。
POI屬卵巢早衰（POF）的前期，相对于POF在治疗上有更多逆转的空间。
近年来，POI因其发病率逐渐增高引起了广泛关注。
目前，西医治疗该病以激素替代为主，但不能有效促进卵泡发育[2]，而中药治疗卵巢功能下降在临床取得了较好的疗效[3]。
相关研究发现，mTOR通路与卵泡的生长、发育及增殖有关[4]。
其中mTORC1通过磷酸化下游靶蛋白激酶，介导细胞质量控制和蛋白质合成。
mTORC2通过磷酸化蛋白激酶，进而参与细胞的存活与增殖，因此，mTOR通路为促存活通路。
小鼠植入前胚胎细胞获取时间
雌性昆明白小鼠(合肥安徽医科大学实验动物中心), 4-5周龄。
饲养温度24±2 ℃, 光照时间14 h (8:00–22:00), 自由采食, 饮水。
适应3周后, 选取体重30±2 g的小鼠备用。
当天17:00腹腔注射10 IU PMSG,48h后腹腔注射10 IU hCG。
将注射过hCG的雌鼠不与雄鼠合笼,15h后直接扎破壶腹部获取MII期卵子。
超排处理过的雌鼠按照1:1与成年健康的雄鼠合笼（假定受精时间是当晚12：00）。
次日早上8:00检查阴道见栓情况,若见栓则假定该雌鼠受精。
A.体内组采用体内冲胚法分别在胚胎发育不同时期在输卵管和子宫的不同部位收集
受精卵、2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚、囊胚各期胚胎（在腹腔注射hCG后
22、41、60、67、76、101 h在输卵管的不同部位收集受精卵、2-细胞胚胎、4-细
胞胚胎、8-细胞胚胎、桑葚胚、囊胚）。
B.体外培养组在合笼见栓后, 在腹腔注射hCG后22h直接扎破壶腹部获取受精卵,取
出受精卵,用无糖CZB培养液清洗后,转移至无糖CZB培养液中,37℃,5% CO2的培
养箱中进行培养。
56 h后, 4-细胞胚胎转移至有糖CZB培养液中,37℃,5% CO2的培
养箱中进行培养,收集体外2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚、囊胚（在腹腔注射
hCG后22、41、63、71、77、101 h体外直接收集）。
小鼠胚胎移植操作步骤
小鼠胚胎移植操作步骤小鼠胚胎移植操作步骤如下：
1.准备工具和材料：包括显微操作器械、胚胎移植管、显微镜、培养皿、培养
液、胚胎等。
2.显微操作：在显微镜下，用显微操作器械将胚胎从供体鼠输卵管中取出，放
入培养皿中。
3.胚胎培养：将胚胎放入培养液中，在恒温培养箱中进行培养，保持适宜的温
度和湿度，等待胚胎发育到适合移植的阶段。
4.移植前准备：将受体鼠麻醉，切开子宫口，露出子宫颈。
5.胚胎移植：将培养好的胚胎用移植管轻轻送入受体鼠的子宫内，确保胚胎能
够顺利着床。
6.缝合伤口：用缝合线缝合子宫口，确保伤口不会漏液或出血。
7.术后护理：将受体鼠放回笼中，注意观察其身体状况，及时处理任何异常情
况。
在整个操作过程中，需要注意以下几点：
1.操作前要对手部进行消毒，确保无菌操作。
2.胚胎移植时要轻柔、准确，避免对胚胎造成损伤。
3.术后要给受体鼠提供适宜的环境，保证其身体健康。
4.在整个过程中要严格遵守实验室规定，确保实验安全。
通过以上步骤，可以完成小鼠胚胎移植操作。
这个技术可以用于研究胚胎发育、繁殖生物学等领域，对于提高动物的繁殖效率和推动相关领域的发展具有重要意义。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤以下是小鼠胚胎干细胞的培养实验步骤：1.准备培养基和细胞培养器材：-将培养基预热至37摄氏度。
-准备含有培养基的无菌试管、离心管和细胞培养板。
-洗手并戴上合适的培养操作手套。
2.预处理培养皿：-用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养板彻底洗涤，去除残留的培养基和细胞残留物。
-用0.1%胰蛋白酶溶液或0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞培养板上的细胞进行脱落。
-将细胞均匀地分布在预处理的培养皿中，使其形成单层细胞。
3.检查细胞数目和品质：-用显微镜检查细胞的形态和活力。
-用细胞计数计算细胞的数目。
-计算细胞的分裂倍增时间。
4.细胞传代：-按照需要的细胞密度将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。
-用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养皿上脱落。
-投入适当比例的培养基到新的培养皿中，使其形成单层细胞。
5.制备小鼠胚胎纤维母细胞：-从小鼠胚胎体内收集纤维母细胞。
- 将纤维母细胞转移到含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）和10%胎牛血清的细胞培养皿中。
-培养纤维母细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中直至细胞接触起离皿表面。
6.制备和维持小鼠胚胎干细胞：-转接分裂期的小鼠胚胎干细胞到新的培养皿中。
-用无菌吸管或离心管的尖端轻轻挑取细胞克隆。
-将细胞克隆转移到含有mESC培养基（如DMEM、15%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1×LIF（小鼠白细胞介素-6）的细胞培养板中。
-在体外细胞培养中维持小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖。
7.细胞培养的常规维护：-定期更换新鲜的培养基。
-检查细胞的形态和活力。
-定期传代细胞，以保持其细胞数目和活力。
-控制培养基和细胞的污染。
以上是小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤，实验过程可能因研究目的和实验室的要求而有所不同。
为了保证实验的准确性和可重复性，建议在实验过程中随时记录和保留实验数据，并使用正确的实验操作和生物安全规范。
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小鼠窦前卵泡的最佳共培养方法探讨 卵泡是卵巢内的基本功能单位，包含一个卵母细胞、颗粒细胞及膜细胞〔1〕。卵泡膜间质细胞 ( theca －interstitial cells，TIC) 是卵巢中除卵泡外具有分泌雄激素功能的间质细胞，它在卵泡的生长发育、闭锁过程中发挥着多种重要作用〔2 －4〕，同时作为卵巢微环境的主体成分之一，TIC 参与了卵巢衰老〔5〕及多囊卵巢综合征等卵巢相关疾病〔6〕的发生发展。为了能够进一步深入研究 TIC 对卵巢功能的影响及其作用机制，在体外构建一个可最大程度模拟体内环境下卵泡与TIC 相互关系的共培养模型是十分有意义的。目前卵泡的培养主要包括二维法和三维法，而共培养方法包括直接接触式和非直接接触式。本研究拟采用海藻酸钠凝胶 ( alginate hydrogel，ALG) 和 Transwell 构建 3种共培养模型，从卵泡的形态观察、生长发育、存活率、激素分泌水平和减数分裂恢复情况等方面进行综合评价，旨在探索一种最佳的共培养方法。
1 材料和方法 1. 1 实验动物 由武汉大学动物实验中心提供 SPF级 C57BL/6 小鼠，动物处理过程遵守动物保护与使用原则，并获华中科技大学同济医学院动物保护委员会批准。
1. 2 主要试剂 Lebovitz＇s L －15 培养基( Invitrogen) 、－MEM 培养基 ( Hyclone) 、注射用重组人促卵泡激素( Merck serono) 、FBS( Gibco) 及 hCG( 赤峰博恩药业有限公司) ，其他试剂均购自 sigma 公司。
1. 3 卵泡膜间质细胞的分离与培养 分离 21 ～ 25 日龄 C57BL/6 雌鼠的卵巢，针刺以尽量多地释放出卵泡中的颗粒细胞。将残余组织充分剪碎后用消化液( McCoy＇s 5a 培养基 +4 mg/ml 胶原酶Ⅳ +10%胎牛血清) 37℃消化 1 h，每 15 min 吹打 1 次。将消化好的细胞 悬 液 进 行 离 心 ( 1 000 rpm，5 min) ，并 用McCoy＇s 5a 培养基清洗 1 次。最后所得的细胞用 TIC 培养基 ( McCoy＇s 5a 培养基 +10% 胎牛血清 +100 IU/ml青霉素 + 0. 1 mg/ml 链霉素) 重悬，接种于 24 孔板或 Transwell 滤膜 ( Corning，#3422) 底侧面 ( 倒置于 12 孔板中) ，每孔细胞数约为 1 × 105个，置于37℃ 、95% O2～ 5% CO2培养箱中培养 24 h，细胞贴壁后将 Tranwell 按正常位置置于24 孔板中，加入 TIC培养基。
1. 4 窦前卵泡的分离 用 29 号胰岛素针针头针刺14 ～ 16 日龄 C57BL /6 雌鼠的卵巢，分离得到窦前卵泡，置于维持液 ( －MEM 培养基 +1%FBS +100 IU/ml青霉素 + 0. 1 mg/ml 链霉素) 中，37℃、95% O2～5% CO2培养箱中孵育 30 min。选择具备以下特征的健康卵泡用以下一步包埋或培养: ①直径在110 ～140 μm之间; ②具有完整连续的基底膜，无明显因操作造成的卵泡损伤; ③卵泡中央可见一个未成熟的卵母细胞; ④无明显窦腔形成。
1. 5 卵泡与卵泡膜间质细胞的共培养 1. 5. 1 海藻酸钠凝胶法 将卵泡膜间质细胞接种于 24孔板底部，孵育过夜，更换卵泡生长培养基 ( － MEM培养基 + 10%FBS +ITS +10 mIU/ml FSH +100 IU/ml 青霉素 + 0. 1 mg/ml 链霉素) ，600 l/孔。将 5 个窦前卵泡转移至 2% ( w/v) 无菌海藻酸钠液珠中，充分浸入包埋液 ( 50 mM CaCl2+ 140 mM NaCl) 中交联2 min形成凝胶，再将海藻酸钠胶珠置入 24 孔板内，记为共培养第零天。
1. 5. 2 Transwell 间接接触法 将卵泡膜间质细胞接种于 24 孔板底部，更换 500 μl 卵泡生长培养基，放入 Transwell 小室，加入 100 μl 卵泡生长培养基，直接吸取 5 个卵泡转移至上室内。
1. 5. 3 Transwell 直接接触法 将培养于 Transwell 小室底侧面的卵泡膜间质细胞置于 500 μl 卵泡生长培养基中，直接吸取 5 个卵泡转移至含 100 μl 卵泡生长培养基的上室内。
1. 5. 4 培养基更换 每组包含 20 ～ 30 个卵泡，于37℃ 、95% O2～ 5% CO2培养箱中培养 6 天，隔天半量更换新鲜配制的卵泡生长培养基，收集培养基冻存于 －80℃，用于激素检测。
1. 6 评价方法 1. 6. 1 卵泡形态、直径、存活率监测〔7〕: 从第 1 天开始，隔天用倒置相差显微镜观察卵泡形态并拍照，用 ImageJ 软件测量卵泡直径 ( 取长轴和短轴的平均值) 。通过观察卵泡形态判断是否存活，将具有以下特征的卵泡视为死亡卵泡: ①卵泡或卵母细胞碎裂、皱缩，尺寸缩减; ②卵母细胞不再由颗粒细胞层包绕; ③颗粒细胞变暗或碎裂。
1. 6. 2 激素分析 收集共培养第 2、4、6 天 1 /2 的培养基冻存于 －80℃冰箱，用直接化学发光法测定睾酮、雌二醇。
1. 6. 3 卵母细胞的减数分裂能力评价〔7 －8〕: 培养结束后，用含 10IU/ml 海藻酸钠裂解酶的 － MEM 培养基替换原有的培养基，在 37℃、95% O2～ 5% CO2培养箱中孵育30 min。将卵泡从裂解的海藻酸钠凝胶中转移至成熟培养基 ( maturation medium: － MEM 培养基 + 10% FBS + 5 ng/ml EGF + 1. 5 IU/ml hCG +100 IU / ml青霉素 + 0. 1 mg / ml 链霉素) 中，在 37℃ 、95% O2～ 5% CO2培养箱中孵育 16 ～20 h，进行体外成熟 ( IVM，in vitro maturation) 。然后用 0. 3% 透明质酸酶处理卵泡，并用吸管轻轻吹打，使卵母细胞从卵泡中裸露出来。观察卵母细胞并按以下方法进行分类: ①生发泡期 ( GV，germinal vesicle) : 卵母细胞在 hCG 的作用下未恢复减数分裂，可见卵母细胞的细胞核持续存在; ②生发泡破裂期( GVBD) : 卵母细胞核膜消失，生发泡不可见; ③减数第二次分裂期( MII，metaphase II) : 卵母细胞恢复减数分裂，停滞在减数第二次分裂期，在卵母细胞周围可见第一极体; ④退化( DG，degenerated) : 卵母细胞碎裂或皱缩。
1. 7 统计分析 所有实验均独立重复 5 遍以上，运用 SPSS 18. 0 统计软件进行数据处理与分析，计量资料采用 ( x ± s) 表示，卵泡直径、激素水平的组间比较采用单因素方差分析 ( ANOVA) ，卵泡存活率和减数分裂阶段采用 χ2检验，P ＜ 0. 05 表示有统计学差异。
2 结果 2. 1 3 种共培养方法下卵泡的生长发育 海藻酸钠凝胶包埋的卵泡在体外培养的 6 天中始终维持了卵泡的三维结构，并可以清晰观察到卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞 ( 图 1A － C) 。培养结束时可以观察到处于偏心位置的卵母细胞，部分卵泡的卵母细胞周围可见窦腔形成，而在 Transwell 中培养的两组，镜下观察到卵泡结构较不清晰，颗粒细胞与卵泡膜细胞的分界不清，在培养到第 3 天开始，卵泡内的颗粒细胞开始贴壁生长，卵泡直径急速增加，培养到第 5 天时，部分卵泡的颗粒细胞向外扩散增殖，导致卵泡结构的破坏，而这种现象在海藻酸钠凝胶法中的发生率很低。在 3 种共培养方法中，卵泡的生长发育均呈现出两个阶段 ( 图 2) : 培养第 5 天前，卵泡生长缓慢，之后卵泡则开始加速生长。在起始卵泡直径控制在110 ～ 140 μm 的前提下，在培养的第 1 天、第 3 天各组间卵泡直径均无统计学差异 ( P ＞ 0. 05) ，卵泡存活率也无统计学差异 ( 分别 为 91. 1%、89. 1%、88. 2% ) ，见表 1。在培养到第 5 天时，海藻酸钠凝胶法的卵泡生长加速幅度明显低于 Transwell 内的两组，使得三维培养的卵泡直径小于 Transwell 内的卵泡 ( 180. 3 ± 39. 6) 、 ( 209. 4 ± 59. 3) 、 ( 226. 4 ±62. 6) μm，P ＜ 0. 05，而 Transwell 直接接触法和间接接触法之间无统计学差异。第 5 天的卵泡存活率也出现差异，海藻酸钠凝胶法 ( 77. 3%) 和 Transwell直接接触法 ( 76. 5%) 要高于 Transwell 间接接触法( 57. 4%) ，P ＜0. 05，海藻酸钠凝胶法和 Transwell 直接接触法之间无统计学差异。【表1】 2. 2 激素分泌 3 种共培养方法中，睾酮的分泌水平在第 2、4、6 天均逐渐升高，且各组间无明显差异( 图 3) ，而雌二醇水平在 3 组中的分泌情况与相应卵泡的直径增长情况相一致。第 2 天和第 4 天，3 组间均无统计学差异，但到第 6 天，Transwell 间接接触法( 2 752. 4 ±341. 6) pg/ml 和 Transwell 直接接触法 ( 2651. 0 ± 318. 9) pg / ml 中雌二醇的分泌量明显高于海藻酸钠凝胶法 ( 1 097. 6 ± 34. 0) pg/ml，P ＜ 0. 001，Transwell 间接接触法和 Transwell 直接接触法之间无统计学差异。2. 3 体外成熟 ( IVM) 后卵母细胞减数分裂恢复情况 在体外培养 6 天后，选择镜下观察形态完整的存活卵泡进行体外成熟。在海藻酸钠凝胶法中 66. 7%的卵母细胞能够恢复减数第一次分裂，其中 17. 3%能够排出第一极体恢复减数第二次分裂，而 Transwell间接接触法和 Transwell 直接接触法的 GVBD 率分别为64. 2%、66. 7%，MII 率分别为 14. 0%、6. 0%。3组间在 GV、GVBD、MII、DG 的比例上均无统计学差异，见表 2。【表2】
3 讨论 海藻酸钠凝胶是近年来应用比较广泛的卵泡三维培养材料，在小鼠模型中可成功培养出活的、健康的、并能产生后代的卵泡，卵泡和卵母细胞均能生长达到与在体发育相似的直径〔9〕，而且颗粒细胞可进行增殖，分泌雌二醇、孕酮、雄烯二酮至周围培养基中。通过共培养方法，能够将卵泡体外培养的起始阶段提前至早期次级卵泡，甚至初级卵泡。如与胚胎成纤维细胞 ( MEFs)〔7〕进行共培养，这种常用于促进胚胎干细胞未分化生长的饲养细胞能够提供卵泡存活和生长所必需的关键旁分泌因子，从而使得早期次级卵泡 ( 平均直径为 90 ～100 μm) 和初级卵泡 ( 平均直径为 70 ～80 μm) 得以在体外生长至 251 ～347 m，形成窦腔，获得较高的存活率 ( 分别为 70% 和23% ) ，而且大多数的卵泡能够恢复减数分裂。有学者〔10〕利用卵巢间质细胞 ( 主要成分为膜细胞和卵巢巨噬细胞) 作为饲养细胞，模拟小卵泡在体内的环境，提高雄激素的生成，补充缺乏的细胞因子，显着促进了初级卵泡和早期次级卵泡的生长和存活。此外，在其他物种中，如水牛的大窦前卵泡与多种卵巢