第八章- 1 - 第八章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatograph)
第一节 概述（Generalization）
以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、 高效液相色谱法的特点
目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。达到传质阻力小，分离效率高。早期HPLC的固定相用涂渍的方法制备，液膜厚度df大，这和GC一样，会大大降低色谱柱的柱效。现代HPLC填料大多采用键合固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了柱效。高效固定相会带来什么新问题呢？使用高效填料带来两个新问题：一是柱流动阻力大大增大，因此需要采用高压泵输液；二是表面能很大，要采用专业的装柱技术。
光合作用中的光合色素定量分析方法
光合作用是生命中极为重要的化学反应过程之一。它是在光合体内某些色素的协同作用下完成的。光合色素在光合作用过程中承担着非常重要的角色。测量和分析光合体内的光合色素含量对于深入理解光合作用机制和其对环境变化的响应具有重要意义。
光合色素的定量分析方法可以分为三种：光度法、荧光法和高效液相色谱法。下面分别分析一下各种方法的原理和优缺点。
一、光度法
光度法是一种通过比较待测样品与标准溶液的吸光度来确定光合色素浓度的方法。常用的光度计有紫外分光光度计和分光比色计。在紫外区域，因为光合色素具有特征性的吸收谱，因此可以用紫外分光光度计直接测量吸光度。而在可见光区域，由于光合色素种类增多，吸收谱互相混叠，因此需要用分光比色计对不同波长下的吸光度进行测定。
优点：此方法操作简单，对于大量样品的测定方法较为便利。
缺点：光度法需要标准品，标准品制备和保管质量对稳定分析结果影响较大，且无法分析光合色素种类。
二、荧光法
荧光法是利用叶绿素的荧光性质进行测定。由于荧光与激发荧光的波长、激发光强度、荧光素浓度等因素之间有确定的关系，因此可以通过荧光特性分析荧光强度，进而分析样品中荧光素浓度。
优点：荧光法具有灵敏度高、选择性强、操作简便的特点，可同时测定多种光合色素种类，并且不需要标准曲线。
缺点：此法对荧光素的浓度变化较为敏感，在某些实验条件下易受干扰，如样品中其他物质造成的荧光波长重叠。
三、高效液相色谱法
高效液相色谱法是目前最为常用的光合色素定量方法。该方法利用高效液相色谱仪分离不同种类的光合色素，并通过紫外检测器对色素进行定量分析。
优点：高效液相色谱法可以分离已知和未知的光合色素种类，准确分析各种光合色素含量，并可以消除样品中其他物质在分析中产生的干扰。
缺点：此方法操作复杂，需要较高的仪器设备和技术要求，并且需要使用贵重的试剂和色谱柱。
综上所述，各种光合色素定量分析方法各有优劣。实验者应根据自己的具体需求和实验条件选择合适的方法。在保证实验精度和稳定性的前提下，应尽可能考虑实验成本和效率。
仪器分析实验的课后习题答案及讨论 2
高效液相色谱
1．高效液相色谱法的特点
特点：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精确度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
2. 高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点：
(1)进样方式的不同：高效液相色谱只要将样品制成溶液，而气相色谱需加热气化或裂解；
(2)流动相不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力；
(3)由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小4~5个数量级；
(4)由于流动相的化学成分可进行广泛选择，并可配置成二元或多元体系，满足梯度洗脱的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率（柱效能）；
(5)高效液相色谱采用5~10Lm细颗粒固定相，使流体相在色谱柱上渗透性大大缩小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相；
(6)高效液相色谱是在液相中进行，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如，紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等。
3. 高效液相色谱的定性和定量分析的方法 定性：（1）利用纯物质定性的方法
利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。
（2）利用文献保留值定性
相对保留值r21：相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。
定量：有归一法、内标法、外标法
在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等，但高效液相色谱在分离复杂组分式样时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而内标法定量则被广泛使用。
CHINA FOOD SAFETY 111分析检测
高效液相色谱法测定果汁饮料中 苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量辛明彦（浮山县综合检验检测中心，山西临汾 042600）摘 要：目的：建立高效液相色谱-紫外检测器测定果汁饮料中苯甲酸、山梨酸及糖精钠3种食品添加剂的分析方法。方法：果汁饮料试样用纯水提取，经AcclaimTM 120 C18色谱柱分离，用紫外检测器测定。结果：苯甲酸、山梨酸及糖精钠在1.00～50.00 mg/L线性良好，相关系数均大于0.999，3种添加剂的检出限均为 0.005 g/kg，定量限均为0.015 g/kg，加标回收率为91.7%～109.0%，RSD为1.29%～3.36%。结论：该方法前处理简便、分析速度快、准确度高及精密度好，可用于上述3种添加剂的定性、定量检测。关键词：高效液相色谱；果汁饮料；食品添加剂Determination of Benzoic Acid, Sorbic Acid and Saccharin Sodium in Fruit Juice Drinks by HPLCXIN Mingyan(Fushan County General Inspection and Testing Center, Linfen 042600, China)Abstract: Objective: The method for the determination of benzoic acid, sorbic acid and saccharin sodium in fruit juice drinks by HPLC with UV detector was established. Method: Pear juice beverage samples were extracted with pure water, separated by AcclaimTM120 C18 chromatographic column and determined by UV detector. Result: The linearity of benzoic acid, sorbic acid and saccharin sodium is good at 1.00～50.00 mg/L, the correlation coefficient is greater than 0.999, the detection limit of the three additives is 0.005 g/kg, the quantitative limit is 0.015 g/kg, the recovery is 91.7%～109.0%, and the RSD is 1.29%～3.36%. Conclusion: The method has the advantages of simple pretreatment, fast analysis speed, high accuracy and good precision. It can be used for the qualitative and quantitative detection of the above three additives.Keywords: high performance liquid chromatography; fruit juice beverage; food additives随着我国社会经济发展与食品工业水平的提升，人们对饮料类食品的消费需求日益增长，果汁类饮料以其口味佳、富含维生素与矿物质等优势深受广大消费者喜爱[1-3]。然而，部分生产厂家在果汁饮料生产过程中为改善口味、延长货架期会添加甜味剂、防腐剂等食品添加剂，消费者过量摄入会对身体健康产生影响[4-8]。苯甲酸与山梨酸是国内食品企业最常用的防腐剂，糖精钠是食品生产中最常用的甜味剂，《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[9]中规定果蔬汁类饮料中苯甲酸最大使用量为1.0 g/kg，饮料类中山梨酸最大使用量为0.5 g/kg，糖精钠不得使用，因此上述3种食品添加剂在果汁饮料中超范围或超限量使用是违法的。本研究参照《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）[10]中液相色谱法，以果汁饮料为基体，建立了高效液相色谱-紫外检测器测定果汁饮料中苯甲酸、山梨酸及糖精钠含量的分析 方法。1 材料与方法1.1 材料与试剂果汁饮料购自某超市；苯甲酸标准溶液[编号GBW（E）100006，1.00 mg/mL]，山梨酸标准溶液[编号GBW（E）100007，1.00 mg/mL]，糖精钠标准溶液[GBW（E）100008，1.00 mg/mL]，均由中国计量科学研究院提供；甲醇（色谱纯，德国默克）；乙酸铵（色Copyright©博看网. All Rights Reserved.112 食品安全导刊 2022年4月分析检测
