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枯草芽孢杆菌SC_2产直链肽类代谢产物的分离纯化_邹远军

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现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2017, Vol.33, No.5 85 枯草芽孢杆菌SC-2产直链肽类代谢产物的分离纯化

邹远军，宋欣沛，郑一敏，罗颉，钟猛，宋婷，胥秀英 （重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054） 摘要：为了研究枯草芽孢杆菌SC-2发酵液主要抗菌活性物质，以临床致病菌株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、白色念珠菌等为指示菌，采用打孔法检测抑菌活性，对SC-2发酵液抑菌粗提物进行分离纯化。抑菌粗提物经硅胶柱层析、LH-20凝胶柱层析和高效液相色谱法分离制备得到抑菌单体化合物GNH-2。该物质表现出广谱的抗菌活性，在质量浓度为1 mg/mL时对白色念珠菌、大肠杆菌和大肠埃希氏菌抑菌圈直径分别为34±0.30 mm、18±0.15 mm、19±0.10 mm，对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌的抑菌活性分别为28±0.10 mm、30±0.10 mm、56±0.35 mm，优于同等浓度的万古霉素。通过能与茚三酮直接显色等实验结果，初步推断GNH-2属于直链的肽类化合物，为后续结构确证和新药开发提供依据。 关键词：枯草芽孢杆菌；分离纯化；抑菌活性；直链肽类化合物 文章篇号：1673-9078(2017)5-85-90 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.5.014

Separation and Purification of Straight-chain Peptide Metabolites

Produced by Bacillus subtilis SC-2 ZOU Yuan-jun, SONG Xin-pei, ZHENG Yi-min, LUO Jie, ZHONG Meng, SONG Ting, XU Xiu-ying (College of Pharmacy and Bioengineering, Chongqing University of Technology, Chongqing 400054, China) Abstract: In order to study the main antimicrobial substances in the fermentation liquid of Bacillus subtilis SC-2, clinical strains of pathogenic methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Propionibacterium acnes, and Candida albicans were used as indicator strains, antimicrobial activity was measured using the agar diffusion method, and the crude extracts of SC-2 fermentation liquid were separated and purified. The crude extract containing antimicrobial substances was separated by silica gel column chromatography, Sephadex LH-20 gel column chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC) to yield a monomeric compound, GNH-2, with antibacterial activity. This substance showed broad-spectrum antimicrobial activity. At a concentration of 1.0 mg/mL, the GNH-2 inhibition zone diameters against Candida albicans, Escherichia coli, and E. coli 251 were 34±0.30 mm, 18±0.15 mm, and 19±0.10 mm, respectively. The GNH-2 inhibition zone diameters against S. aureus, MRSA, and Propionibacterium acnes were 28±0.10 mm, 30±0.10 mm, and 56±0.35 mm, respectively, which were better than those of vancomycin at the same concentration. The results of ninhydrin coloration preliminarily suggested that GNH-2 was a straight-chain peptide. This work provides the basis for subsequent structure confirmation and new drug development. Key words: Bacillus subtilis; separation and purification; antimicrobial activity; straight chain peptides

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、痤疮丙酸杆菌（P.acnes）和白色念珠菌（C.albicans）等都是医院感染的重要病原体，随着抗生素、抗癌药物以及免疫抑制剂的广泛应用，病原微生物的耐药性日益增强，因此寻找一种新的安全、无毒抗感染药物替代品具有重大的社会价值[1~3]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种好氧产芽孢的革兰氏阳性杆菌，其生理特征多样，易于分离培养，能够产生多种抗菌代谢产物，被认为是具有潜在的、能有效抑制病原菌的有益菌[4]，具有很高的医用价值[5]。目前已研究的枯草芽孢杆菌 收稿日期：2016-06-22 作者简介：邹远军（1990-），男，硕士研究生，主要从事微生物药物的研究 通讯作者：郑一敏（1963-），男，教授，主要从事天然药物研究与开发 大多产生环脂肽类的抗菌物质，如枯草菌表面活性素（Surfactin）、伊枯草素（Iturin）、芬枯草素（Fengycin）等[5,6]，这些环肽类物质与茚三酮染色前需要酸水解才

能显色，而对于直链肽类物质则可以用茚三酮直接显色[7]，目前鲜有直链肽类抗菌物质的相关报道。本实

验室近年来从食用酸菜中分离筛选得到一株枯草芽孢杆菌SC-2，本研究首先检测了该菌株活性粗提物的抑菌谱，通过实验摸索利用现代色谱技术对枯草芽孢杆菌SC-2发酵液抑菌粗提物进行分离纯化，最终利用硅胶色谱柱层析、LH-20凝胶色谱柱层析和高效液相色谱法这一实验路线分离制备得到活性物质GNH-2。GNH-2具有广谱的抗菌活性，对MRSA、金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌抗菌活性明显优于同等浓度的万现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2017, Vol.33, No.5 86 古霉素（治疗MRSA首选药物[8]）；应用薄层色谱法（TLC）和茚三酮直接染色技术检测到GNH-2能与茚三酮直接显色，质谱分析其分子量为376，初步推断GNH-2属于小分子直链的肽类化合物，这些结果将为下一步的结构确定和后续研究工作提供详实依据。

1 材料和方法

1.1 原料 1.1.1 供试菌株 SC-2菌株：本实验室自行从酸菜中分离得到，通过形态观察、生理生化实验和16s rDNA分子生物学实验[9]，最终鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

供试指示菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA44、MRSA45）、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、

大肠埃希氏菌、痤疮丙酸杆菌、白色念珠菌，均由本实验室保存。 1.1.2 培养基与试剂 菌株SC-2发酵培养基：葡萄糖20.0 g，酵母粉5.0 g，硫酸镁0.5 g；超纯水1000 mL，pH 7.0~7.2。 LB固体培养基：酵母提取物5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂15.0~20.0 g，超纯水1000 mL，pH 7.0~7.2。 CM0787培养基：牛肉膏10.0 g，蛋白胨5 g，酵母粉3 g，葡萄糖5 g，淀粉1 g，氯化钠5 g，醋酸钠3 g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g，琼脂15 g，超纯水1000 mL，pH 6.8。 改良马丁培养基：蛋白胨5 g，硫酸镁0.5 g，磷酸氢二钾1 g，葡萄糖20 g，酵母粉2 g，琼脂1.7 g，超纯水1000 mL。 大孔吸附树脂，天津浩聚树脂科技有限公司；柱层析硅胶，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司；柱层析凝胶，上海金穗生物科技有限公司；TLC分析板，烟台江友硅胶开发有限公司；茚三酮，成都科隆试剂有限公司；其它柱层析试剂均为国产分析纯，高效液相色谱所用为色谱纯。

1.2 仪器与设备 发酵罐，Dansence3000-JES10-50L；SP-DJ系列水平净化工作台，上海浦东物理光学仪器厂；HZP-250型全温振荡培养箱，上海精宏实验设备有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；H-1650型台式离心机，湖南湘仪仪器有限公司；JM1812-1卷式膜小型试验机，大连屹东膜工程设备有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器

厂；DL-400循环冷却器，郑州长城科工贸有限公司；SHZ-C型循环水式多用真空泵巩义市英峪仪器厂；LC-20A型Shimadzu高效液相色谱仪，日本岛津公司；Waters 3100 Mass Detector；色谱分析柱，Welchrom C18，5 μm，4.6×250 nm；Welchrom LP-C18，5 μm，4.6×250 nm；半制备柱Boston Crest ODS，5 μm，10.0×250 nm；XS105DU型电子天平，梅特勒托利多仪器有限公司。

1.3 方法 1.3.1 抑菌试验方法 采用打孔法进行抑菌试验。分别从斜面上挑取一环各指示菌菌种接入10 mL无菌蒸馏水中，调整菌液浓度为108 CFU/mL，取菌悬液100 μL均匀涂布于相

应固体培养基平板(培养基厚5 mm)上。用灭过菌的打孔器（直径为6 mm）在平板上打孔，定量将待测样品溶液加入所打孔中（以样品溶液与培养基表面齐平为准）。最后将平板平放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径大小，以确定样品抑菌活性。 1.3.2 菌株SC-2抑菌粗提物的制备 菌株SC-2发酵液经8000 r/min、离心10 min收集上清液，再经0.22 μm过滤膜过滤除菌，上清液用卷式膜浓缩截留300~1000活性部分；然后用H103大孔树脂提取活性物质，取其50%乙醇解吸附液减压浓缩；最后再用8000 r/min、离心10 min收集上清液冷冻干燥得到浅黄色粉末粗提物，即抗菌粗提物。 1.3.3 菌株SC-2抗菌粗品的抑菌谱测定 采用琼脂扩散打孔法测定SC-2抗菌粗品对指示菌的抗菌活性。分别在CM0787培养基上接种痤疮丙酸杆菌，改良马丁培养基上接种白色念珠菌，LB固体培养基上接种其它剩余指示菌，涂布均匀，然后在上面打孔，往孔里加入过滤除菌的粗品水溶液50 μL，经37 ℃培养24 h后用游标卡尺测定平板上抑菌圈的直径。做三次平行试验，取平均值。 1.3.4 SC-2抑菌粗提物的硅胶柱层析分离 称取300~400目硅胶160 g溶于3倍氯仿甲醇系统（三氯甲烷:甲醇=7:3），搅拌均匀并超声脱气，湿法装柱，平衡压实（柱高20 cm，直径为6 cm）。另取SC-2抑菌粗提物5 g加适量蒸馏水溶解后，与50 ℃水浴锅上拌与硅胶中，蒸干碾成粉末，干法上样。使用氯仿-甲醇-水洗脱系统进行梯度洗脱，每个梯度洗脱约6 BV，每50 mL洗脱液收集为一个馏分，总计收集120瓶。将收集到的洗脱液分别浓缩后，进行TLC薄层分析（展开剂为三氯甲烷:甲醇:水=5:5:0.5），展开

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毕赤酵母表达风味强化肽的分离与纯化

毕赤酵母表达风味强化肽的分离与纯化

毕赤酵母表达风味强化肽的分离与纯化田雪;张宝持;白小佳;王艳萍【摘要】为了开发新型风味强化剂,采用硫酸铵分段盐析法、中空纤维超滤、阴离子交换树脂分离等方法,对构建的工程茵P.postoris GS115-16B2发酵表达的16拷贝风味强化肽的分离纯化效果进行研究.实验结果表明,分离纯化最佳方法为:首先使用中空纤维进行超滤浓缩,经过两次稀释过滤浓缩后的浓缩液再采用离子交换树脂DEAE-52进一步分离纯化.经SDS-PAGE检测,纯化后16拷贝风味强化肽的平均纯度可达93.19％.%The separation and purification method of 16 copies flavor enhancing peptide from Pichia Pastoris fermentation broth was studied by fractional salting out, hollow fiber ultra filtration and anion exchange resin. The results showed the best separation and purification method. The broth was first ultra filtration enriched twice by hollow fiber column, and then further purified by ion-exchange resin DEAE-52. After the purification, the average purity of 16 copies flavor enhancing peptide was 93.19% detected by SDS-PAGE.【期刊名称】《天津科技大学学报》【年(卷),期】2011(026)004【总页数】4页(P14-17)【关键词】毕赤酵母;风味强化肽;盐析;中空纤维超滤;离子交换树脂;分离纯化【作者】田雪;张宝持;白小佳;王艳萍【作者单位】食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457【正文语种】中文【中图分类】Q503风味强化肽最初是从牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分离得到的一种八肽，它与食盐、味精有较好的协同呈味作用，并且具有很好的热稳定性，适合于食品工业生产中的热处理要求.因此，风味强化肽有望代替味精成为新一代风味强化剂，具有广阔的市场前景.随着分子生物学的发展和应用，数百种外源蛋白实现了在毕赤酵母、酿酒酵母等表达体系中的成功表达[1–2]，然而发酵液中目的蛋白难以分离纯化已成为影响其应用的主要问题.尤其是各种肽，由于其分子质量小，表达出来的产物难于分离[3]. 本实验室构建出带有16拷贝风味强化肽的高效表达载体，并将其整合到毕赤酵母(Pichia pastoris)进行诱导表达[4].本文在前期工作的基础上，对构建的工程菌P. postoris GS115-16B2发酵表达的16拷贝风味强化肽的分离纯化方法作了探索性尝试，即分别运用硫酸铵分段盐析法、中空纤维超滤、阴离子交换树脂分离方法和两步分离法进行分离纯化，寻找出较好的分离纯化工艺.1.1.1 菌种Pichia pastoris GS115-16B2，毕赤酵母基因组整合有16拷贝风味强化肽基因，由本实验室保存.1.1.2 试剂与仪器外源蛋白发酵样品由本实验室制备；DEAE–52阴离子交换树脂，南开大学化工厂；硫酸铵(分析纯)，天津市天大化工实验厂.中空纤维超滤膜(截留相对分子质量为 6,000、60,000)，天津膜天膜公司；Power,PAC,3000电泳仪和全自动凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司.1.2.1 发酵液预处理将收集到的发酵液在 6,000,r/min离心 20,min，除去大部分菌体，然后加热到100,℃煮沸 5,min，使大部分蛋白酶失活，迅速降温，于－20,℃储存备用.1.2.2 硫酸铵分段盐析一级盐析：取发酵上清液适量分装，每瓶200,mL.将硫酸铵烘干研细，按质量分数为 30%、35%、40%、45%、50%和 55%向发酵上清液中缓慢加入硫酸铵，不断搅拌至完全溶解，4,℃静置 2,h，6,000,r/min、4,℃离心 20,min，沉淀溶于蒸馏水中，透析，SDS-PAGE检测，找到目标蛋白16拷贝风味强化肽沉淀较少而杂蛋白沉淀最多时的硫酸铵质量分数.二级盐析：取发酵上清液适量，按照一级盐析的最适硫酸铵质量分数盐析，然后将离心得到的上清液分装，每瓶 200,mL.向上清液中缓慢加入硫酸铵粉末，不断搅拌至完全溶解，使硫酸铵质量分数分别为60%、70%、80%和90%.4,℃静置 2,h，6,000 r/min、4,℃离心20 min，弃上清液，将沉淀溶于蒸馏水中，透析，并取相对应的上清液进行透析，SDS-PAGE检测.1.2.3 发酵上清液的中空纤维超滤将预处理过的发酵液通过截留相对分子质量为60,000的中空纤维超滤膜，将小于60,000的超滤液再通过截留相对分子质量为6,000超滤膜，收集相对分子质量大于6,000的浓缩液，保存于－20,℃冰箱中.1.2.4 阴离子交换层析分离采用 DEAE–52层析柱(1.0,cm×40,cm)，流量为0.5,mL/min，用4～5个柱体积的缓冲液平衡层析柱，含 NaCl 浓度分别为 0、0.10、0.15、0.20、0.25,mol/L的Tris-HCl(pH,7.0)缓冲液进行梯度洗脱.回收率＝(洗脱液中蛋白质量浓度×体积)/(原液蛋白质量浓度×体积)×100%1.2.5 蛋白质量浓度与蛋白含量的测定方法应用 Bradford法[5]测定发酵液总蛋白质量浓度.SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白含量[6].2.1.1 一级盐析的确定将预处理后的发酵液用 HCl或 NaOH调节 pH至等电点 3.94.以硫酸铵作为盐析剂，在不同盐析质量分数下对16拷贝风味强化肽进行分段盐析沉淀实验，结果如图1所示.目的蛋白相对分子质量为2.5×104，从图 1可知，当硫酸铵质量分数为 45%以下时，蛋白沉淀较少，当达到50%时，开始出现较多的沉淀.因此，本研究选择一级盐析时硫酸铵质量分数为45%.2.1.2 二级盐析选择硫酸铵质量分数 45%进行一级盐析，通过SDS-PAGE检测，结果如图2所示. 结合图 1和图 2可知，当硫酸铵质量分数为45%～60%时，蛋白质的溶解度随溶液质量分数的增加而降低，沉淀蛋白电泳条带越来越浓，当在 70%～90%时，硫酸铵溶液质量分数增加而沉淀蛋白电泳条带相对变稀.为了得到更多的沉淀蛋白，本研究选择二级盐析时硫酸铵质量分数为60%.采用硫酸铵盐析的方法在粗提阶段提高所需蛋白纯度，这在很多相关文献中都有提及，如罗磊等[6]的“一步沉淀法”，Siegelman等[7]的“分步沉淀法”，胡一兵等[8]的“分段梯度盐析法”，但这些方法或产物纯度低，或重复性差，或盐析次数多，或盐析段过于狭窄等.本实验首先进行 0%～45%的硫酸铵盐析，这段沉淀物可以抛弃(去除大多数杂质)；然后进行 45%～60%的硫酸铵盐析，可以得到较好的盐析效果.但是从图1和图2可以看出，当硫酸铵饱和度为 60%～90%时，上清液中仍然含有大量纯度较高的目标蛋白，回收率太低，因此放弃使用硫酸铵盐析的方法进行粗分，并且尝试使用中空纤维方法分离、浓缩目标风味肽.稀释过滤即是在膜分离过程中向料液中加入渗透溶剂(一般是水)，使小分子和渗透溶剂一起去除，直到达到所需要的分离要求.显然，如果产品是大分子，稀释过滤类似于洗涤；而当产品是小分子时，产品液体将被稀释.因 16拷贝风味强化肽相对分子质量小于 60,000，当通过截留相对分子质量 60,000的超滤膜时，是将溶液中的大分子杂质去除.为了提高16拷贝风味强化肽的回收率，必须采用稀释过滤.图3为中空纤维超滤膜浓缩后发酵液的 SDS-PAGE凝胶电泳图.3、8和12泳道为浓缩后相对分子质量在6 000～60,000样品，其蛋白浓度明显比 5号对照泳道深，说明经过中空纤维超滤膜浓缩后，16拷贝风味强化肽目的蛋白被高效浓缩；4、9和 13泳道蛋白条带很淡甚至没有条带，说明 6,000滤出液只含有少量的蛋白，达到很好的超滤浓缩效果.通过预备实验，选择缓冲液pH为7.0，检测洗脱液在220,nm下的吸收峰，得到洗脱曲线如图4所示.图4结果显示，Tris-HCl-NaCl梯度洗脱曲线在8、19、30、40和 49号管分别出现较高吸收峰，选择这些吸收峰以及其附近的洗脱液，进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图5所示.根据图 5可知，目标蛋白在第 40～49管洗脱液中析出，此时 NaCl浓度为0.25,mol/L，其中 46～49管洗脱液样品纯度较高.首先使用中空纤维进行超滤浓缩，浓缩分别经过两次超滤，得到相对分子质量在6,000～60,000的蛋白质，考马斯亮蓝结果显示其蛋白质量浓度为6.34,g/L，回收率达到 59%；采用 DEAE–52进行进一步分离纯化，经 SDS-PAGE检测，纯化后 16拷贝风味强化肽平均纯度可达 93.19%.将得到最佳的结果进行SDS-PAGE电泳，结果如图6所示.蛋白质分离纯化很难用单一方法实现，往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质[9].理想的蛋白质分离提纯方法要求产品纯度和总回收率越高越好，但实际上两者难以兼顾，因此，考虑分离提纯的条件和方法时，不得不在两者之间作适当的选择；一般情况下，科研上更多地选择前者，工业生产上更多地选择后者.因此，每当需要提纯某种蛋白质时，首先要明确分离纯化的目的和蛋白质的性质，以便选择最佳的分离纯化方法，从而得到理想的效果[10].本研究将预处理过的发酵液进行分离纯化.分别采用了硫酸铵盐析法、中空纤维超滤法和 DEAE–52进行纯化.经过实验确定最佳方法为：首先使用中空纤维进行超滤浓缩，浓缩分别经过两次超滤，通过截留相对分子质量分别为60,000和6,000的膜，得到相对分子质量范围在6,000～60,000之间的蛋白质，回收率达到59%；采用 DEAE–52进一步分离纯化，经SDS-PAGE检测，纯化后16拷贝风味强化肽平均纯度可达93.19%.【相关文献】［1］Shi X，Karkut T，Chamankhah M，et a1. Optimal conditions for the expression of a single-chain antibody(scFv)gene in Pichia pastoris[J]. Protein Expr Purif，2003，28(2)：321–330.［2］官孝群，王跃祥，吴良成，等. 血管生成抑制因子 K4K5 cDNA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[J]. 生物工程学报，2001，17(2)：126–130.［3］朱家文，武斌，陈葵，等. 离子交换层析分离纯化重组人血清白蛋白[J]. 华东理工大学学报：自然科学版，2002，28(4)：341–345.［4］王艳萍，高文，侯建华，等. 牛肉风味强化肽(BMP)表达载体的构建[J]. 天津科技大学学报. 2008，23(3)：16–20.［5］Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1979，72：248–254.［6］Guo Y J. Protein electrophoretic technique[M]. Beijing：Science Press，1998：54–58. ［7］罗磊，丁霄霖. 聚丙烯酰胺凝胶电泳研究硫酸铵盐析分离猪血清 IgG[J]. 食品研究与开发，2006，27(1)：82–88.［8］Siegelman H W，Kycia J H. Algal biliproteins：Handbook of phycologicalmethod[M]. Cambridge：Cambridge University Press，1978：71–79.［9］胡一兵，胡鸿钧，李夜光，等. 从一种富含藻胆蛋白的螺旋藻中大量提取和纯化藻蓝蛋白的研究[J]. 武汉植物学研究，2002，20(4)：299–302.［10］Wang H X，Ng T B. Purification of castamollin，a novel antifungal protein from Chinese chestnunts [J]. Protein Expression and Purification，2003，32(1)：44–51. ［11］Wang H X，Ng T B. Alocasin，an anti-fungal protein from rhizomes of the giant taro Alocasia macrorrhiza[J]. Protein Expression and Purification，2003，28(1)：9–14.。

兽用抗生素诺西肽(nosiheptide)的研究进展

兽用抗生素诺西肽(nosiheptide)的研究进展

［!］ 内提取出来 ， 提取过程分粗提和精制两个步骤。 ［ !! ］ 文献报道的一种粗提方法流程 如图 " 所示：
H I J:， 是出发菌株的 7K = 倍， 已经形成了一套完整的发酵工 艺。已通过兽药临床试验， 获得国家新兽药证书， 其饲料 添加剂逐渐在畜牧饲养业上得到应用， 具有 广 阔 的 市 场
［ 6" ， 6Q ］ 量、 培养基组成等方面 。周佩等对诺西肽的发酵工艺 ［ !Q ， !L ］ 进行了比较详细的研究 ， 获得了较为适用于工业生产
A<? 69 +,/ B-83/ 4B 83<=4 8@<7 -/*<7(/* 4B =4*<,/0:<7/ 9 9 由图 6 可以很清楚地看出通过稳定同位素前体的加入 和 CDE 分析得到的诺西肽的组成信息。其中： 7/8’8 和 >(: 骨架分别是由 ./- 和 +,- 脱水得到的； :,; 是由 #)* 和 ./- 合 成； 0)-<7<=/ 是由两分子 ./- 残基尾尾相连而合成的； <=74’/ 骨架是 +-0 通过一种特殊的重排方式而形成的； :,-、 @)*、 ?’( 则分别来自于相应的氨基酸。 #" 生物合成基因 根据对已知的含杂环的抗生素的新生肽链合成的机
［ !P ］ 目前诺西肽的检测方法主要有分光光度法 ， 微生物 ［ !H ］ ［ !J ， !$ ］ 效价 测 定 法 ， 薄层色谱法 ， 高效液相色谱法 ［ 6% ， 6! ］ （ VG1#） 。其中分光光度法测定诺西肽的含量能快速
合成。
万方数据 球素 G! 等抗生素的生物合成是由非核糖体蛋白合成酶
［;］ 培养后产生的 ， 后来的研究者又找到了产生诺西肽的其
枯草芽孢杆菌二步发酵法生产5'-肌苷酸

枯草芽孢杆菌二步发酵法生产5'-肌苷酸

枯草芽孢杆菌二步发酵法生产5'-肌苷酸何菊华;吴雪娇;谢希贤;徐庆阳;张成林;陈宁【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2015(041)005【摘要】5'-肌苷酸作为新一代增味剂的重要组成成分,在调味品行业具有十分重要的地位.为进一步缩短5'-肌苷酸生产周期,降低生产成本,在研究来源于摩氏摩根菌Morganella morganii的酸性磷酸酶AP/PTaseM催化条件基础上,将该酶编码基因phoCYM克隆至肌苷生产菌株Bacillus subtilis JG,获得B.subtilis JAB和B.subtilis JAF,并根据重组菌株合成肌苷及表达酸性磷酸酶的特性,通过调控发酵条件实现了肌苷发酵和酶催化相偶联的二步发酵法生产5'-肌苷酸.经摇瓶发酵实验验证,两菌株5'-肌苷酸产量分别为2.4 g/L和3.0 g/L.【总页数】6页(P24-29)【作者】何菊华;吴雪娇;谢希贤;徐庆阳;张成林;陈宁【作者单位】天津科技大学生物工程学院,天津,300457;天津科技大学生物工程学院,天津,300457;天津科技大学生物工程学院,天津,300457;天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室,天津,300457;代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室,天津,300457;天津科技大学生物工程学院,天津,300457;天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室,天津,300457;代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室,天津,300457;天津科技大学生物工程学院,天津,300457;天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室,天津,300457;代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室,天津,300457;天津科技大学生物工程学院,天津,300457;天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室,天津,300457;代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室,天津,300457【正文语种】中文【相关文献】1.葡萄糖对维生素C二步发酵法生产2-酮基-L-古龙酸影响的研究 [J], 赵军;康艳红;杨伟超;王纯利;徐慧2.发酵法生产5‘—肌苷酸的研究进展 [J], 王贞富;王可3.发酵法生产5`—肌苷酸的研究：Ⅰ.高产菌株的选育 [J], 杨志荣;曾英4.发酵法生产5‘—肌苷酸的研究进展 [J], 王贞富5.用葡萄糖以二步发酵法生产1，3—丙二醇的研究 [J], 龚家玮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

(Z)-2-(2-甲氧亚胺基)呋喃乙酸合成工艺研究

(Z)-2-(2-甲氧亚胺基)呋喃乙酸合成工艺研究

第53卷第3期 辽 宁 化 工 Vol.53，No. 3 2024年3月 Liaoning Chemical Industry March，2024收稿日期： 2023-06-29(Z)-2-(2-甲氧亚胺基)呋喃乙酸合成工艺研究陈胜思（南京科瑞健医药科技有限公司， 江苏 南京 210044）摘 要： 以2-乙酰呋喃为起始原料合成了(Z)-2-(2-甲氧亚胺基)呋喃乙酸，收率达86%，最佳肟化反应工艺条件：甲氧胺盐酸盐为1.8 eq ，反应体系pH 为3.0，温度为10 ℃，时间10 h ，转化率99.13%，Z 构型选择性92.63%。

(Z)-2-(2-甲氧亚胺基)呋喃乙酸降解符合一级反应动力学，pH 越低，降解越快。

关 键 词：头孢呋辛； 呋喃铵盐； (Z)-2-(2-甲氧亚胺基)呋喃乙酸； 肟化； 降解 中图分类号：TQ251.1 文献标识码： A 文章编号： 1004-0935（2024）03-0382-04头孢呋辛是由英国GSK 公司研发的第二代头孢类抗生素，其主要作用机理是与细菌细胞膜上的青霉素结合蛋白（PBPs ）结合，抑制细胞分裂和生长，最后使细菌溶解和死亡[1]。

头孢呋辛具有广谱抗菌作用，适应范围广，临床上主要用于敏感菌所致的下呼吸道、尿路、皮肤及软组织等感染，以及脑膜炎、败血症和淋病等[2-5]。

1988年头孢呋辛被FDA 批准于美国上市，该药自上市以来，即成为世界畅销药品之一[6]。

头孢呋辛在国内外市场依旧拥有良好的销售势头，到目前为止仍在抗生素市场中占据不可或缺的位置。

到2023年1月，CDE 官网有近30家原料药厂备案生产头孢呋辛原料药。

在全球巨大的市场形势下，性价比较优的头孢呋辛钠的优势会更加凸显，需求和产量将持续增加[7-9]。

呋喃铵盐是合成头孢呋辛的关键中间体，其化学名称为(Z)-2-甲氧亚氨基-2-呋喃基乙酸铵，英文名称是(Z)-2-Methoxyimino-2-(furyl-2-yl) acetic acid ammonium salt ，简称：SMIA ，分子式：C 7H 10N 2O 4，分子量：186.17，CAS 号：97148-39-5，结构式见图1。