PCR反应及琼脂糖电泳实验报告

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实验四 逆转录PCR (RT-PCR)

【实验目的】

1．了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。

2．学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。

【实验原理】

聚合酶链式反应〔PCR〕过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。RT-PCR将以RNA为模板的cDNA〔complement DNA〕合成〔即RNA的反转录〔RT，reversetranscription〕〕，同cDNA的PCR结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。由于cDNA包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。

RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。

RT-PCR的基本原理〔图〕。首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成 cDNA，即总RNA中的mRNA在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA〔cDNA〕；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸〔dNTP〕为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。

在RT时，有3种引物可选择 〔表4.1) 。用1〕和2〕方法，理论上是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR的模板继续扩增。如果用3〕方法，先要去 :// 查它的序列，并用oligo等软件设计引物。

1 / 10 分子生物学实验报告 实验内容：设计一个完整的实验，以水稻基因组为例，最终得到纯化的一个基因片段。 2 / 10 水稻基因组DNA提取以及基因片段的扩增、纯化和检测 1.实验目的： 1.1 熟练掌握实验室分子生物学相关的仪器的规范使用方法 1.2 遵守实验室相关的实验规章制度，服从实验人员的管理 1.3 熟练掌握实验室有关植物基因组DNA的简单提取方法以及检测方法 1.4 了解琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握胶体制备的方法以及电泳仪的操作方法 1.5 掌握PCR技术的操作流程，熟练使用PCR仪并了解其工作原理及检测方法 1.6 了解柱纯化的原理及使用方法 2.实验原理 1）水稻叶片基因组DNA提取 水稻属于真核生物，其DNA以双链线性高分子形式存在于细胞核中，一般以染色质形式在。由于植物组细胞破裂之后，DNA酶会水解DNA因此在提取过程总要加入EDTA螯合剂从而抑制DNA酶活性。 水稻叶片基因组DNA的提取主要是通过破碎组织和细胞从而通过对细胞内其他杂质的去处来达到基因组DNA的提纯。提纯的产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检验。 本实验是通过CTAB法来进行提取的，它是一种阳离子表面活性剂，能溶解细胞膜和和核膜蛋白，使核蛋白解聚从而使DNA游离出来，已达到分离的目的。 2）特定基因片段的PCR扩增 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在95℃ 3 / 10 下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(55℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在TaqDNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经30轮循环就可使DNA扩增上百倍。 3）PCR产物的纯化 PCR产物的纯化在本实验中是通过柱纯化的方法进行的。试剂盒吸附柱中的硅胶膜可以再高盐度的缓冲液下结合DNA，在通过低盐度的缓冲液洗脱，通过这样的纯化过程去除了除特定产物外的其他DNA样品以及各种杂质。 4）DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶电泳是利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应来达到混合物分离的目的。DNA分子的迁移速率与其相对分子质量成反比，此外不同构型的DNA分子的迁移速率不同（cccDNA>ｌDNA>ocDNA)。通过EB染色即可在紫外灯下观察到胶体中DNA的纯度、大小等情况。 3.实验试剂和实验仪器 1）实验试剂 CTAB提取液、苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1)、氯仿/异戊醇(24:1)、EDTA、异丙醇、70%乙醇；Taq 酶、PCR Buffer、引物、dNTP、ddH2O；PB、PW、EB（Elution Buffer）；西班牙琼脂糖、TAE、EB（溴化乙锭）溴酚黄、Marker。 2）实验仪器 移液器一套、离心管架、电子天平、水浴锅、微波炉、高速离心机、电泳系列设备、研钵、紫外透射仪、PCR仪、漩涡振荡器、掌上离心机、 4 / 10 3）实验耗材 配套的不同规格枪头、不同规格离心管、吸附柱、乳胶手套、PE手套以及鞋套。 4.实验步骤 1）水稻叶片基因组DNA提取及检测 a.加1mlCTAB研磨0.2g水稻叶片，时间不超过5分钟，并迅速转移300ul至2ml离心管中，再加300ulCTAB混匀后放入65度恒温水浴锅中水浴30分钟，每个5分钟混匀一次。 b.向冷却后的离心管中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，轻微颠倒混合后，室温下12000rpm离心10min。 c.取上清液体300ul转移到新的1.5ml离心管中后加入等体积的氯仿/异戊醇，轻微颠倒混合，12000rpm离心10min。 d.取上清250ul转移至新的1.5ml离心管中，加500ul异戊醇颠倒混匀，12000rpm离心10min。去上清吸干异戊醇。 e.加0.5ml70%乙醇洗涤3-5分钟，12000rpm离心10min，重复一次后将乙醇完全晾干。 f.加150ulddH2O溶解DNA。取3uL样品在1%琼脂糖凝胶电泳中检测DNA浓度和纯度。剩余样品-20度保存。 2）基因片段的PCR扩增及产物检测 a.以小组为单位配置MIX，加上阴性对照总共需配13管MIX，按实际用量的120%算后得到以下实际的加入量： 试剂名称 μl/反应 计算用量 实际用量 ddH2O 15.38 239.928 239.9 5 / 10 b.按照上面的配方用1.5ml的离心管取液，取液顺序依次为：ddH2O、PCR、Buffer、dNTP、Primer、Taq 酶（5U/μl）。 c.混匀后分装到13个标记的PCR管中，每管22ul。分装完成后再向PCR管中对应的加入6个阳性对照(3ul的标准DNA模板)、6个样品基因组（3ul）以及一个阴性对照（3ulddH2O）。 d.加完样后对离心管进行振荡离心，后放置于冰上暂存。 e.将样品以及对照组的PCR管放入PCR仪中，设定如下程序进行扩增： 95℃ 1min 95℃ 20s 60℃ 30s 30 cycles 72℃ 30s 72℃ 1min 15℃ for ever f.在扩增的过程中进行琼脂糖凝胶的制备，在得到PCR产物后加5ul的ddH2O进行稀释，后取3ul的产物按3：1的比例将样品与溴酚黄混合均匀点样，并开始电泳的过程。 g.电泳结束后对胶体进行EB染色，并在紫外仪下观察并检测PCR产物的浓度及纯度。 3）PCR产物的纯化及检测 a.向样品管中加入20ul的PCR产物，同时加入5倍体积的PB溶液，吹打均匀。 b.将混匀的液体转移到吸附柱中，静置后8000rpm离心30S，将收集管中的废液倒掉后吸干管口处液体。 PCR Buffer 2.5 39 39 dNTP 2 31.2 31.2 Primer 2 31.2 31.2 Taq 酶（5U/μl） 0.12 1.872 1.872 6 / 10 c.再向吸附柱中加入730ul的PW溶液，8000rpm离心30S，去除废液，在空甩一次后将吸附柱放入1.5ul的EP管中收集纯化产物。 d.用22ulEB溶液对吸附柱进行洗脱，静置5分钟后12000rpm离心2min，收集纯化产物。 e.用1.5%的琼脂糖凝胶对纯化的产物和未纯化前的样品进行对照电泳，检测纯化的效率。 4）琼脂糖凝胶电泳（*注：参与整个过程） a.根据基因组片段的大小配取不同浓度的胶（如基因组DNA检测时配的是1%的胶，PCR产物检测则用的是1.5%的胶）。将溶有琼脂糖的锥形瓶放入微波炉中加热煮沸，目的是使琼脂糖溶解，过程中要再煮沸时拿出来摇几下，目的是赶走胶中的气泡。 b.等无气泡后使其冷却至60度左右，将胶倒入插好梳子的平板中，过程要轻、慢，但也不能过慢防止其过快凝固。 c.待胶冷却凝固后，将其放入750ml的电泳槽中，加上缓冲液，点样。 d.打开电泳仪开关，设定好电压时间后，开始电泳。等条带跑出胶体的1/2左右时关闭电泳仪。 e.取出胶体，到暗房进行EB染色，大约10分钟，之后进行照胶观察。 7 / 10 5.实验结果及分析 1）水稻叶片基因组DNA提取 点样顺序：D2000, 11 DNA samples，Hind ⅢΛDNA 图（1）：水稻基因组DNA电泳图谱（22号泳道的样品为笔者基因组DNA的电泳结果，其中M1——D2000,M2—— Hind ⅢΛDNA） 结果分析：由上图22泳道的电泳结果可知，最上面一条带为水稻基因组DNA，大小约为23Kb左右，亮度不高说明所提的基因组DNA的浓度不够，此外在该条带下方有大片杂带区域，说明所得的样品中有很多断裂的基因以及部分RNA,分析原因可能有以下几方面： a．在研磨水稻叶片时研磨程度不够或者研磨时间过长导致基因组DNA大量降解，最终导致提取的叶片基因组DNA含量偏少，致使其浓度不够，电泳后染色所得到的条带暗淡，且有大片杂质区域。 b．提取过程中摇动的幅度过大或者因为水平摇动，导致液体产生涡流将基因组DNA片段搅断，使基因组DNA的含量降低，而断裂的DNA含量增加，杂带增加。 c．操作过程中的DNase酶的污染，使得基因组DNA降解。 d．溶解DNA时有乙醇未晾干，导致点样时样品上漂，使得电泳结果中基因组DNA浓度下降。这也可能是有些组同学在前期基因组DNA提取时无条带而后期有PCR产物的所谓“复活”现象产生的原因。 8 / 10 2）基因片段的PCR扩增 点样顺序：阳性（+）与样品间隔点样，Maker点中间，阴性（—）对照分别点在两组样品的末端 图（2）：PCR扩增的基因片段电泳图（22号泳道的样品为笔者PCR产物的电泳结果，其中22+为提供的标准的PCR产物，M——D2000） 结果分析：由上图22和22+泳道的电泳结果分析可知，通过基因组DNA 与特定引物结合并扩增的PCR产物大小在600bp左右，且条带明显，说明所得的产物浓度较高，和所提供的阳性对照组的电泳结果基本一致。但下方仍存在弥散状的小片段物质，经分析该杂质可能为引物二聚体以及少量的RNA和DNA片段。相对所给的样品来说PCR产物下方的杂带要少，这可能和引物加入量以及其他MIX成分的含量过高有关。针对目的条带下出现的杂带区域的原因分析如下： a．实验操作过程中不小心混入空气中或衣物上的小分子RNA或者DNA片段，影响实验结果的纯度。 b．在配置MIX溶液时加入的引物浓度相对过高，导致引物二聚体的大量产生，形成杂带。 此外，由于PCR的过程只需要少量的基因组DNA甚至是某些断裂的片段就可以得到高浓度的产物，所以这也可能是某些组同学在之前基因组DNA提取过程中没有或者有很淡的条带，也能得到较好的PCR产物，成功“复活”的原因之一。 9 / 10 3）PCR产物的纯化 点样顺序：PCR产物与纯化产物（c）间隔点样，Maker在中间 图（3）：PCR产物纯化前后对比的电泳图（22泳道为笔者未纯化的PCR产物电泳图，22c为纯化后的PCR产物电泳图，其中M——D2000） 结果分析：由22和22c泳道的电泳结果可知，PCR产物纯化的效果很好，产物下方所出现的弥散状杂带已基本没有，与之前的PCR产物相比较纯度大大提高。但是通过其他组的纯化后的产物观察可得，部分组纯化后的产物仍可见少量杂带（例如18c和19c），分析其原因可能有以下几方面： a．空气中或者衣物上的小分子基因片段混入点样的样品中污染样品，影响纯化效果。 b．在取样过程中纯化前样品对纯化后样品的交叉污染，或者是操作人员疏忽未更换枪头导致的等。 6.实验总结与讨论 本次分子生物学实验主要是以水稻叶片为原材料对其基因组DNA进行提取、目的片段进行扩增以及PCR产物的纯化，就几次实验结果的检测来看，整个实验还算是比较成功的。 首先是水稻叶片基因组DNA的提取。由于在大三下学期做过相关的植物基因组DNA提取试验，因此依旧记忆犹新，实验操作过程中的一些值得注意的地方都小心处理，例如：在温浴时，研磨液需要每个5min左右摇动一次，由于此 10 / 10 时DNA处于溶解状态，所以摇动时要注意上下颠倒，避免产生涡流而导致基因组DNA的断裂，同时在溶解DNA后也要注意摇匀时要上下颠倒，因此最终得到了较为理想的实验结果。 其次是目的片段的PCR扩增。在PCR扩增的过程中最关键的步骤是MIX的配制，过量的引物会产生大量的引物二聚体，过量的dNTP、Taq酶也会造成弥散的杂带出现，因此合理的PCR体系十分关键。 最后就是PCR产物的纯化。这步实验主要是通过试剂盒操作的，所以总体来说较简单。但是需要避免点样过程中的交叉污染造成纯化后结果不理想的情况。 针对实验过程中其他小组所出现的阴性结果、“复活”现象讨论如下： 在做基因组DNA提取检测的结果中13、15组基本属于阴性结果，在相应位置几乎看不到基因组DNA的电泳条带。相反，13组有大量分布弥散的区域，很有可能是其在提取基因组DNA过程中应操作失误而是样品大量断裂，最终形成阴性结果。而15组除了没有基因组DNA外，其他杂带区域也基本没有，很有可能是在提取过程中操作严重失误导致样品完全丢失，或者是点样时样品没有点到孔中造成的。 然而在PCR产物的电泳结果图中， 15组依旧没有任何目的条带，只有底部出现由于引物二聚体存在而导致的亮斑，说明15组提取样品中的确没有基因组DNA。而13组出现了浓度较高的产物，即“复活“现象，而这个现象可以分以下几种情况来解释： a．13组样品的基因组DNA含量较少加上点样时的失误造成最终电泳结果出现假阴性，但是由于PCR的灵敏度高，因此在PCR扩增后产物浓度依然能达到一定高度，所以成功“复活“。 b．13组样品中的确不含有基因组DNA，但是由于断裂片段中可能含有该引物所能扩增的完整片段所以，在PCR过程中依旧可以得到较好的PCR产物，形成假阳性的现象，从而得以“复活”。 c．13组样品中含有基因组DNA但是由于用乙醇洗涤是乙醇没有晾干，导致溶解的DNA溶液中含有乙醇，点样时造成样品上漂，造成了假阴性的结果。

pcr扩增dna实验报告

一、实验目的

本次实验旨在通过聚合酶链式反应（PCR）技术对特定 DNA 片段进行扩增，以加深对 PCR 原理和操作过程的理解，并熟练掌握相关实验技能。

二、实验原理

PCR 是一种在体外快速扩增特定 DNA 片段的技术。其基本原理基于 DNA 半保留复制的机制。在反应体系中，包括 DNA 模板、引物、脱氧核苷酸（dNTPs）、热稳定 DNA 聚合酶以及适当的缓冲液。

反应过程分为三个主要步骤：

1、 变性：通过高温（通常为 94 98℃）使 DNA 双链解开，成为两条单链。

2、 退火：降低温度（通常为 50 65℃），使引物与单链 DNA 模板上的互补序列结合。

3、 延伸：在 DNA 聚合酶的作用下（通常在 72℃），以 dNTPs 为原料，从引物的 3'端开始沿着 5' 3'方向合成新的 DNA 链。

经过多次循环上述三个步骤，DNA 片段得以指数级扩增。

三、实验材料与设备 1、 材料

待扩增的 DNA 模板

特异性引物

dNTPs 混合物

Taq DNA 聚合酶

10×PCR 缓冲液

无菌去离子水

2、 设备

PCR 仪

微量移液器

离心管

电泳仪

琼脂糖凝胶

紫外凝胶成像系统

四、实验步骤

1、 反应体系的配制

在无菌离心管中，依次加入以下成分： 无菌去离子水：＿____μL

10×PCR 缓冲液：＿____μL

dNTPs 混合物（各 25 mM）：＿____μL

上游引物（10 μM）：＿____μL

下游引物（10 μM）：＿____μL

Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）：＿____μL

DNA 模板：＿____μL

总体积为_____μL。

2、 将离心管中的反应混合物轻轻混匀，短暂离心，使反应液集中于管底。

3、 PCR 反应程序设置

预变性：95℃，5 min

变性：95℃，30 s

退火：＿____℃，30 s

分子生物学实验报告

实验二 从 cDNA 文库中靶片断扩增（ 4h ）

一、实验目的

1. 掌握聚合酶链式反应的原理。

2. 掌握移液枪和 PCR 仪的基本操作技术。

二、实验原理：

PCR 技术，即聚合酶链反应 （Polymerase Chain Reaction ， PCR） 。经典的 PCR 过程包括：变性 （denaturing step ）、退火（ annealing step ）和延伸（ extension step ）三个步骤。变性过程，即在高温 94℃ ~98 ℃下，模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之形成两条单链 ssDNA 。随后， 模板 DNA 与引物的退火 （复性 ）过程中，温度降至 55℃左右，特异序列的引物与模板 DNA 单链的互补序列 配对结合； 之后，引物的延伸过程， DNA

模板 -引物结合物在耐热的 DNA 聚合酶 （如： Taq 酶）的作用下， 以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补 的半保留复制链。重复循环变性 --退火 --延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可 成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4 分钟， 2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR 反应的成分和作用：

总体积：一般为 25μ l ～100 μl

（一）无 Mg2+buffer ：由纯水、 kcl 、Tris 组成。 Tris 用于调节反应体系 pH 值，使

Taq 酶在偏碱性环 境中反挥活性。 kcl 可降低退火温度，但不能超过 50 mmol/L ，否则会抑制

DNA 聚合酶活性。 （二） Mg2+: 终浓度为 1.5 ～ 2.0mmol/L ，其对应 dNTP 为 200 μ mol/L ，注意Mg2+ 与

dNTPs 之间的 浓度关系， 由于 dNTP 与 Taq 酶竟争 Mg2+ ，当 dNTP 浓度达到 1 mmol/L 时会抑制 Taq 酶的活性。 Mg2+