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从PBMC中提取总RNA

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一、从PBMC中提取总RNA
（一）试剂：
1．invitrogen公司的TRIzol Reagent
2．氯仿
3．异丙醇
4．75%乙醇（用DEPC水配制）
5．RNase-free 水或SDS溶剂（配制RNase-free 水的方法：将水倒入RNase-free 的玻璃瓶，加
入DEPC使其终浓度为0.01%（v/v），过夜，然后高压灭菌。SDS溶剂需用灭菌后的DEPC
水配制。）
（二）仪器设备：
1．低温离心机
2．移液枪
3．RNase-free 的试管、Tip头
4．水浴箱
（三）方法步骤：
1．匀浆：将提取到的PBMC离心成片状沉淀，每5～10×106个细胞加入1ml的TRIzol reagent，
用移液枪反复抽吸溶解细胞。2～8℃低温中12，000×g离心10min，离心得到的片状沉淀为细
胞外膜，多糖和高分子的DNA等，上清中则溶解有RNA，将上清移至干净的试管中。
2．相分离：
（1） 将上述匀浆上清置15～30℃环境中孵育5min，使核蛋白完全离解。
（2） 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡试管15秒，然后置15～30℃
环境中孵育2～3min。
（3） 2～8℃ 低温中≤12，000×g离心15min。离心后混合液即分离成三层，下层红色的苯酚
-氯仿相、中间界面和上层水相，RNA就单独溶解在上层水相中。水相体积约为所用TRIzol
试剂的60℅。
3．沉淀RNA：将步骤2中的有机相留作提取DNA和蛋白质用，上层水相则移至另一干净的试管
中，加入异丙醇沉淀其中的RNA（0.5 ml异丙醇/1ml TRIzol reagent），置15～30℃环境中孵
育10min，然后2～8℃ 低温中≤12，000×g离心10min，即可在试管底部见到凝胶状的RNA沉
淀。
4．洗涤RNA：弃去上清，用75%的乙醇洗涤RNA沉淀（至少1 ml乙醇/1ml TRIzol reagent），旋
涡振荡器混匀，2～8℃ 低温中≤7，500×g离心5min。
5．RNA再溶解：小心倒去乙醇，将RNA沉淀在空气或真空中晾干（约5～10min，注意不能置真空
环境中离心干燥，也不要将其完全干燥以至难于溶解）。用移液管加入DEPC水，置55～60℃水
浴箱孵育10min溶解RNA。也可用100%去离子的甲酰胺溶解RNA并置-70℃冰箱中长期保存。
*该试剂盒提供了三种保存RNA的方法：
（1）匀浆后加入氯仿前的样本，可置-60～-70℃冰箱中保存至少一个月；
（2）步骤4中溶于75%乙醇的RNA，可置2～8℃冰箱中保存至少一周；或于-5～-20℃冰箱中保
存至少一年。
（3）提取完成后，于100%去离子的甲酰胺溶解RNA并置-70℃冰箱中长期保存

蛋白质的提取
准备试剂：异丙醇 含0.3M盐酸胍的95%乙醇 无水乙醇 1%SDS
操作步骤：
1. 样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml TRIzol加0.3ml
无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2-8℃不超过2000×g离心5分钟。
2. 取上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2-8℃12000
×g离心10分钟弃上清。
2．用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1ml TRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，
2-8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。
3．真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解，不溶
物2-8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20℃保存备用。
注意事项：
1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。
2．用0.1% SDS在2-8℃透析三次，10000×g离心10分钟取上清即可用于Western Blot。
常见问题分析：
得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B．最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解
蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻
电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分

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总RNA的提取与电泳

总RNA的提取与电泳

总结词
电泳条带不清晰或出现弥散会影响对RNA质量的评估。
详细描述
电泳条带不清晰或弥散可能是由于RNA样品中存在杂质、电泳条件不合适、电泳槽未 彻底清洗等原因造成的。为解决这一问题，可以尝试对RNA样品进行再次纯化、调整
电泳条件、清洗电泳槽等方法。
实验操作中的安全问题
总结词
总RNA提取与电泳实验涉及多种危险因素， 需采取安全措施。
通过总RNA提取和电泳，可以对特定 组织或细胞中的基因表达谱进行分析， 了解基因在不同条件下的表达变化。
转录组学研究
总RNA提取和电泳是转录组学研究的 重要手段，有助于揭示基因转录水平 和调控机制，为疾病机制和药物研发 提供重要信息。
在疾病诊断和治疗中的应用
诊断标志物筛选
通过总RNA提取和电泳，可以发现与疾病相关的差异 表达基因，为疾病诊断提供新的标志物和检测方法。
核糖体RNA（rRNA）
由DNA转录而来，负责编码蛋白质，是细 胞表达蛋白质的主要方式。
存在于核糖体中，是合成蛋白质的必要成 分。
转运RNA（tRNA）
其他非编码RNA（ncRNA）
负责将氨基酸转运到核糖体，参与蛋白质 合成。
包括小干扰RNA（siRNA）、微小RNA （miRNA）等，在基因表达调控中发挥重要 作用。
详细描述
实验过程中涉及细胞培养、有机溶剂的使用 等，可能产生生物污染和化学污染。为确保 实验安全，应遵循实验室安全规定，穿戴适 当的防护服和手套，避免直接接触试剂和样 品，及时处理废物，保持实验室清洁卫生。
05 总RNA提取与电泳实验的应用和发展前景
CHAPTER
在基因表达研究中的应用
基因表达谱分析
3. 将混合物加入到凝 胶孔中；
植物总rna的提取 思政

植物总rna的提取 思政

植物总rna的提取思政
植物总 RNA 的提取是植物分子生物学研究中的重要环节，它涉及到植物基因表达、转录组学等方面的研究。

在这个过程中，我们可以从以下几个方面融入思政元素：
1. 科学精神与职业道德：在进行植物总 RNA 提取实验时，需要遵循科学的方法和规范，严谨认真地操作。

这培养了学生的科学精神，让他们了解到科学研究需要耐心、细心和实事求是的态度。

同时，也教育学生在实验中要遵循职业道德，尊重实验结果，不篡改数据，培养学生诚实守信的良好品质。

2. 环境保护与可持续发展：在植物总 RNA 提取过程中，可以向学生强调保护环境和可持续发展的重要性。

例如，选择合适的植物材料，避免过度采集导致植物物种的减少。

还可以教育学生在实验结束后正确处理废液和废弃物，减少对环境的污染。

3. 团队合作与责任担当：植物总 RNA 提取通常需要多人合作完成，这培养了学生的团队合作精神。

在实验过程中，每个成员都要承担起自己的责任，认真完成分配的任务，共同努力以确保实验的顺利进行。

4. 创新意识与科学探索：在植物总 RNA 提取实验中，鼓励学生尝试新的方法和技术，培养他们的创新意识。

同时，引导学生对实验结果进行分析和讨论，激发他们的科学探索精神。

通过将思政元素融入植物总 RNA 提取实验教学中，不仅可以提高学生的实验技能，还能培养他们的综合素质，使他们成为具有社会责任感、创新精神和团队合作能力的人才。

总RNA的提取及相关实验方法

总RNA的提取及相关实验方法

总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。

若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。

在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。

TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。

TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。

Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。

细胞总RNA的提取操作步骤

细胞总RNA的提取操作步骤

细胞总RNA的提取操作步骤一、准备1、物品:Trizol、氯仿(三氯甲烷)、异丙醇、75%灭酶异醇、冷PBS、1.5ml灭酶EP管、灭酶枪头、一次性手套、EP管架、吸管2、打开冷冻离心机4?预冷二、操作步骤:将Trizol、氯仿、冷PBS、EP管、灭酶枪头、一次性手套、EP管架、吸管等物品带入细胞室。

1、取出EP管、做好标记2、取出细胞、收集上清保存备用3、用冷PBS冲洗细胞两次4、加入 1ml Trizol (24孔板每孔加0.5ml即可)，调小刻度用移液器吹打细胞至液体澄清(生化:摇动混匀后室温孵育10min)5、将裂解液转移至1.5ml灭酶EP管中，用黄枪头加入氯仿0.2ml(1/5 Trizol体积)，用手剧烈震摇15秒，置室温5min(生化:3min dxyer:15min)，分层6、 4?、12000g(12300rcf)离心15min，可见分层。

7、用黄枪头小心收集上层水相约0.5ml置于另一1.5ml灭酶EP管中(确保不要吸入中间层和有机相)。

8、各管分别加入0.5ml 异丙醇(等体积)，用力摇匀，置室温10min。

(提前将异丙醇4?预冷，或混匀后置-20? 60min，提取效果更好)9、 4?、 12000g离心10min，可见RNA沉淀。

10、倒弃上清，用滤纸吸干管口余液，加入预冷的75%灭酶异醇1ml，用指轻弹管壁使 RNA沉淀飘起洗涤。

11、4?、7500g(7700rcf)离心5min，生化为10min，(亦有dxyer用12000g)，沉淀即为总RNA。

12、弃上清，真空干燥约4min或空气中干燥5~10min，加入20µl(30µl)DEPC 水。

56?水浴小于10min助溶，取少量测OD值，其余-70?保存备RNA制备的问题与解答1、塑料制品、玻璃和金属物品的处理(a)塑料制品:尽可能使用无菌，一次性塑料制品。

已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。