斑马鱼胚胎Western Blots
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斑马鱼胚胎Western Blots
去卵膜&去卵黄
1、每100粒胚胎置入1mg/ml链霉蛋白酶溶液中,时常(24h胚胎5-10min,3天胚胎10-20min)摇晃,分批次除去胚胎的卵膜。用吸管将卵膜轻轻弄破。卵膜会漂浮起来,将其倒出。用冷的Ringer's 溶液漂洗3次(可以参照“如何除去斑马鱼胚胎卵膜”)。
2、将胚胎转移到有EDTA和PMSF的冷Ringer's溶液中。用尖部拉成约卵黄直径大小的玻璃吸管将卵黄捣碎除去。
3、将除去卵膜、卵黄的胚胎转移到新鲜的冷Ringer's溶液中,洗涤2次。
4、将胚胎转移到离心管中,尽量除去液体,然后放入液氮中冰冻并储存在-70℃。
溶液配制:
链霉蛋白酶:
5mg/ml链霉蛋白酶用胚胎培养基稀释成1mg/ml
PMSF:储存液:100mM 苯甲基磺酰氟溶入异丙醇中。使用时每10mlRinger's溶液中立即加入30μl储存液(终浓度0.3mM PMSF)
EDTA:
储存液:10mM EDTA,pH7.0。每10mlRinger'溶液中加入1ml(终浓度1mM EDTA)
准备电泳样品
1、将除去卵膜、卵黄的斑马鱼胚胎从低温冰箱中拿出解冻。
2、离心1-2min。
3、除去残留液体。
4、加入150-200μlSDS样品缓冲液(例如:3天的胚胎加入50-100μl,24h胚胎加入100-150μl,就能够装满一个1.5cm上样槽或四个0.4cm的上样槽,每一个槽可以装样品25-30μl)。
5、用微型杵将样品搅拌均匀。
6、重复步骤5直到样品不再黏稠。
7、沸水浴5min。
8、离心1-2min。
9、将上清转移到新的离心管中。弃去沉淀,或者再次加入样品缓冲液,搅拌均匀后回收上清。
10、-70℃冻存或者立即上样电泳。
溶液配制:
SDS样品缓冲液:0.63 ml 1M Tris-HCl, pH 6.8;1.0 ml 甘油;
0.5 ml ¸-mercaptoethanol;1.75 ml 20% SDS;6.12 ml H2O;
(总共10 ml)分装后于-20℃冻存。
细胞骨架/细胞外基质预处理:
在步骤3和4之间加入一步抽提。
1、将去卵膜,去卵黄的胚胎放入抽提缓冲液中搅拌均匀。
2、4℃放置过夜。
3、5000g离心20min。
4、去上清。
溶液配制:
蛋白抽提缓冲液:10 mM Tris, pH 7.4;2% Triton-X 100 ;1 mM PMSF;1 mM
aprotinin;1 mM leupeptin ;1 mM trypsin inhibitor 上样,电泳和转膜
方法参照Towbin, H., T. Staehelin, and J. Gordon (1979) Electrophoretic
transfer from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and
some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354.免疫印记(使用PBDF吸水纸)
1、抗原被吸附后,将膜倾斜45°的角度浸入封闭液中。室温轻轻摇动60min或者4℃过夜。
2、倒出封闭液,加入TTBS。室温轻轻摇动洗涤10min。
3、倒出TTBS,加入含1%奶粉的TTBS稀释的一抗。室温孵育4hr(或者4℃过夜),缓慢摇动。
4、用TTBS洗涤2次,5min/次,除去没有结合的一抗。
5、加入碱性磷酸酶标记的二抗(用含1%奶粉的TTBS稀释比例1:3000)。室温孵育1-2hr,缓慢摇动。
6、用TTBS洗膜2次,5min/次,在显影前用TBS洗涤5min以除去Tween-20。
7、将膜侵入显影液中。有100ng或更多量的蛋白会立即显色成紫色条带。量少的蛋白显色时间稍长,但是在30min内都可显色。显色时间可以延续4hr。
8、用dH2O漂洗4次,5min/次。
溶液配制:
封闭液:
含3%奶粉的TBS
TBS:20 mM Tris, pH 7.5;500 mM NaCl;
TTBS:20 mM Tris, pH 7.5;500 mM NaCl;0.05% Tween-20
western blot显色液:
66 μl nitroblue tetrazolium (NBT) stock
33 μl 5-bromo-4-chloro-3-indolyl galactopyranoside (BCIP) stock
10 ml color development buffer
NBT和BCIP储存液都是50mg/ml,溶解在二甲基甲酰胺中。NBT储存液是将50mg NBT悬浮在700ml二甲基甲酰胺中,涡旋。加入300μl蒸馏水直到溶解。4℃避光储存。
Western blot显色缓冲液:
102 mg MgCl2
4.2 g NaHCO3
500 ml dH2O