斑马鱼胚胎Western Blots

  • 格式:doc
  • 大小:30.50 KB
  • 文档页数:2

斑马鱼胚胎Western Blots

去卵膜&去卵黄

1、每100粒胚胎置入1mg/ml链霉蛋白酶溶液中,时常(24h胚胎5-10min,3天胚胎10-20min)摇晃,分批次除去胚胎的卵膜。用吸管将卵膜轻轻弄破。卵膜会漂浮起来,将其倒出。用冷的Ringer's 溶液漂洗3次(可以参照“如何除去斑马鱼胚胎卵膜”)。

2、将胚胎转移到有EDTA和PMSF的冷Ringer's溶液中。用尖部拉成约卵黄直径大小的玻璃吸管将卵黄捣碎除去。

3、将除去卵膜、卵黄的胚胎转移到新鲜的冷Ringer's溶液中,洗涤2次。

4、将胚胎转移到离心管中,尽量除去液体,然后放入液氮中冰冻并储存在-70℃。

溶液配制:

链霉蛋白酶:

5mg/ml链霉蛋白酶用胚胎培养基稀释成1mg/ml

PMSF:储存液:100mM 苯甲基磺酰氟溶入异丙醇中。使用时每10mlRinger's溶液中立即加入30μl储存液(终浓度0.3mM PMSF)

EDTA:

储存液:10mM EDTA,pH7.0。每10mlRinger'溶液中加入1ml(终浓度1mM EDTA)

准备电泳样品

1、将除去卵膜、卵黄的斑马鱼胚胎从低温冰箱中拿出解冻。

2、离心1-2min。

3、除去残留液体。

4、加入150-200μlSDS样品缓冲液(例如:3天的胚胎加入50-100μl,24h胚胎加入100-150μl,就能够装满一个1.5cm上样槽或四个0.4cm的上样槽,每一个槽可以装样品25-30μl)。

5、用微型杵将样品搅拌均匀。

6、重复步骤5直到样品不再黏稠。

7、沸水浴5min。

8、离心1-2min。

9、将上清转移到新的离心管中。弃去沉淀,或者再次加入样品缓冲液,搅拌均匀后回收上清。

10、-70℃冻存或者立即上样电泳。

溶液配制:

SDS样品缓冲液:0.63 ml 1M Tris-HCl, pH 6.8;1.0 ml 甘油;

0.5 ml ¸-mercaptoethanol;1.75 ml 20% SDS;6.12 ml H2O;

(总共10 ml)分装后于-20℃冻存。

细胞骨架/细胞外基质预处理:

在步骤3和4之间加入一步抽提。

1、将去卵膜,去卵黄的胚胎放入抽提缓冲液中搅拌均匀。

2、4℃放置过夜。

3、5000g离心20min。

4、去上清。

溶液配制:

蛋白抽提缓冲液:10 mM Tris, pH 7.4;2% Triton-X 100 ;1 mM PMSF;1 mM

aprotinin;1 mM leupeptin ;1 mM trypsin inhibitor 上样,电泳和转膜

方法参照Towbin, H., T. Staehelin, and J. Gordon (1979) Electrophoretic

transfer from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and

some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354.免疫印记(使用PBDF吸水纸)

1、抗原被吸附后,将膜倾斜45°的角度浸入封闭液中。室温轻轻摇动60min或者4℃过夜。

2、倒出封闭液,加入TTBS。室温轻轻摇动洗涤10min。

3、倒出TTBS,加入含1%奶粉的TTBS稀释的一抗。室温孵育4hr(或者4℃过夜),缓慢摇动。

4、用TTBS洗涤2次,5min/次,除去没有结合的一抗。

5、加入碱性磷酸酶标记的二抗(用含1%奶粉的TTBS稀释比例1:3000)。室温孵育1-2hr,缓慢摇动。

6、用TTBS洗膜2次,5min/次,在显影前用TBS洗涤5min以除去Tween-20。

7、将膜侵入显影液中。有100ng或更多量的蛋白会立即显色成紫色条带。量少的蛋白显色时间稍长,但是在30min内都可显色。显色时间可以延续4hr。

8、用dH2O漂洗4次,5min/次。

溶液配制:

封闭液:

含3%奶粉的TBS

TBS:20 mM Tris, pH 7.5;500 mM NaCl;

TTBS:20 mM Tris, pH 7.5;500 mM NaCl;0.05% Tween-20

western blot显色液:

66 μl nitroblue tetrazolium (NBT) stock

33 μl 5-bromo-4-chloro-3-indolyl galactopyranoside (BCIP) stock

10 ml color development buffer

NBT和BCIP储存液都是50mg/ml,溶解在二甲基甲酰胺中。NBT储存液是将50mg NBT悬浮在700ml二甲基甲酰胺中,涡旋。加入300μl蒸馏水直到溶解。4℃避光储存。

Western blot显色缓冲液:

102 mg MgCl2

4.2 g NaHCO3

500 ml dH2O