凹叶景天总黄酮止血和耐缺氧作用研究

一……。　＾　１－∥　—ｒ　２１Ｋ　’…’一一…‘一　２０１６年ｌ２月　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＷＥＮＳＨＡＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　Ｄｅｃ．２０１６　

凹叶景天总黄酮止血和耐缺氧作用研究　常　征　，王　蓉Ｌ　，李洪潮　，刘　伟　，张　铁　。，沈清清　，李付惠　（１．文山学院环境与资源学院，云南文山６６３０９９；　２．云南省高校特色植物开发利用工程研究中心，云南文山６６３０９９）　

摘要：用乙醇提取方法获取凹叶景天总黄酮。采用灌胃给药的方法，给予不同剂量凹叶景天总黄酮，连　续观察１４　ｄ，检测药物对小鼠的急性毒性作用。检测不同剂量凹叶景天总黄酮对小鼠出血凝血时间及对常温　常压缺氧、亚硝酸钠中毒缺氧和急性脑缺血小鼠存活时间的影响。研究表明，凹叶景天总黄酮明显缩短小鼠　出血和凝血时间，延长缺氧小鼠的存活时间，凹叶景天总黄酮具有止血和耐缺氧作用。　关键词：凹叶景天；止血；耐缺氧；急性毒性；最大耐受量　中图分类号：Ｒ２８４．２　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７４—９２００（２０１６）０６—０００４—０４　

凹叶景天为景天科景天属植物凹叶景天Ｓｅｄｕｍ　ｅｍａｒｇｉｎａｔｕｍ　Ｍｉｇｏ的全草，性凉、味苦酸，归心、　肝、大肠经，具有消臃肿，利湿热，利水和血，痔　漏作用，可用于治蛇咬伤，疔疽，便毒，风痹，黄　疸，汗斑【　。民间常以本品鲜品捣烂以菜油浸泡外　擦，治疮疖、无名肿痛，内服用于吐血、便血、月　经过多等，为土家族常用植物药［２－３１。黄酮具有多种　生物活性，是许多药用植物的有效成分，药理作用　主要表现为抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎、镇痛　和调节免疫等作用［４１。目前未见凹叶景天中黄酮的　镇静催眠、止血和耐缺氧作用相关报道。本文初步　探索凹叶景天总黄酮的镇静催眠、止血和耐缺氧作　用，为进一步开发利用凹叶景天提供科学依据。　１　材料　１．１　实验仪器和试剂　１０１型电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪　器厂）、ＨＨ．Ｂ１１．４２０型恒温培养箱（上海市跃进医　疗器械一场）、ＪＡ２００３电子天平（上海舜宇恒平科　学仪器有限公司）、Ｈｚ—Ｄ（１１１）型循环水真空泵（河　南省豫华仪器有限公司）、Ｗ２０１Ｄ恒温水浴锅（上　海申顺生物科技有限公司）、Ｒ一２０１旋转蒸发器　（上海申顺生物科技有限公司）、单相电容运转电动　机（上海申Ｊ顷生物科技有限公司）。　凹叶景天购于文山市小西门中药街，经文山学　院沐建华高级实验师鉴定为景天科景天属植物凹叶　景天。亚硝酸钠（天津市风船化学试剂科技有限公　司）、钠石灰（Ａ型，上海五四化学试剂有限公司）。　１．２实验动物　昆明种小鼠，雌雄各半，体重２０±２　ｇ，购于　昆明医学院动物试验中心，合格证号：滇实动证第　２０１４０１７号。动物按性别分笼饲养。实验期间，室　温控制在２２±２℃，湿度控制在５５±５％，１２　ｈ／１２　ｈ　光暗交替照明，自由进食饮水。本实验所有研究均　遵循国家实验动物委员会相关规定。　

２方法　２．１供试样品的制备　取凹叶景天全草干燥切断、粉碎，用７０％乙醇　在９０℃条件下浸提２次，每次１　ｈ，合并滤液，再　用旋转蒸发仪回收乙醇，将所得浸膏用蒸馏水配制　成浓度（以生药量计）为３０００　ｍｇ／ｍＬ的溶液，即为　凹叶景天总黄酮，置于４℃环境中保存备用［５１。　２．２急性毒性试验研究　参照经典的急性毒性试验方法，进行凹叶景天　醇提物的急性毒性试验１６］。　

收稿日期：２０１６—０９—２０　基金项目：文山学院科研基金项目“生物科学专业提升专业服务产业能力建设项目”（ＺＸ２０１５０１０２）。　作者简介：常征，男，云南马关人，文山学院环境与资源学院副教授，硕士，主要从事生化与分子和药理学研究；王蓉，　女，安徽芜湖人，文山学院环境与资源学院教师，硕士，主要从事中药药理研究；李洪潮，男，云南马关人，文山学院环境与　资源学院副教授，主要从事微生物学研究。　

４　常征，等：凹叶景天总黄酮止血和耐缺氧作用研究　２．２．１半数致死量试验　昆明种小鼠在实验室适应性饲养一周后随机　分成４组：空白对照组、凹叶景天醇提物组（６００、　６０００、６００００　ｍｇ／ｋｇ），每组４只，雌雄各半。给药前　禁食１２　ｈ，不禁水。凹叶景天醇提物组按２０　ｍＬ／ｋｇ　体重灌胃给药１次，空白对照组灌胃等体积的蒸馏　水，进行半数致死量（ＬＤ５０）值的测定。１４　ｄ内无　小鼠死亡，无法计算ＬＤ５０，故进行最大耐受量（ＭＴＤ）　实验。　２．２．２最大耐受量实验　昆明种小鼠在实验室适应性饲养一周后随机分　成２组，分别为空白对照组和凹叶景天醇提物组，　每组ｌ０只，雌雄各半。凹叶景天醇提物组小鼠以生　药量３０００　ｍｇ／ｍＬ（最高浓度），２０　ｍＬ／ｋｇ灌胃凹叶景　天醇提物，２４　ｈ内给药１次；空白对照组给以等体　积蒸馏水。给药后观察小鼠的行为活动，如精神状态、　被毛的变化、摄食饮水是否正常、呼吸、粪便是否　有异样、眼、鼻、口腔有无异常分泌物及死亡等情况，　连续观察１４　ｄ，每天早晚各１次，记录累积死亡数　及小鼠体重变化。死亡动物即刻进行尸检，肉眼观　察其主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）的变化。　２．３对小鼠止血凝血时间的影响　２．３．１　出血时间测定　昆明种小鼠在实验室适应性饲养７　ｄ，随机分　为５组：空白对照组（生理盐水）、云南白药组（６５　ｍｇ／ｋｇ，阳性对照）、凹叶景天总黄酮３４３．６８、１７１．８４　和８５．９２　ｍｇ／ｋｇ三个剂量组，每组１０只，雌雄各半。　空白对照组灌胃给予生理盐水；云南白药组灌胃给　予云南白药溶液；凹叶景天高、中、低剂量组分别　灌胃给予凹叶景天乙醇提取液，给药量为２０　ｍＬ／ｋｇ，　连续６　ｄ。第６天给药ｌ　ｈ后，用利剪于小鼠尾尖１～　３　ｅｍ处横断，待血液自然流出后计时，每隔１５　Ｓ用　滤纸吸去血滴１次，直至血液自然停止，记录并计　算出血时间［７－８１。　２．３．２凝血时间测定　小鼠分组及给药同２．３．１。于第６天给药１　ｈ后，　用内径为ｌ　ｍｍ的玻璃毛细管插入小鼠内眦后静脉　丛取血，血液至毛细管４　５　ｃｍ为止。每隔３０　Ｓ折　断毛细玻管的一小段，检查有无出现血凝丝。从毛　细玻管内眦采血到血液到出现血凝丝的时间，即为　凝血时间。　２．４耐缺氧试验　２．４．１常温常压耐缺氧实验　昆明种小鼠在实验室适应性饲养一周，随机分　为４组：模型组、凹叶景天提取物３４３．６８、１７１．８４　和８５．９２　ｍｇ／ｋｇ　３个剂量组，每组１０只。模型组给予　蒸馏水，凹叶景天高、中、低剂量组分别灌胃给予　凹叶景天总黄酮，每天１次，连续灌胃１４　ｄ，灌胃　量２０ｍＬ／ｋｇ。　于末次给药１　ｈ后，将各组小鼠分别放入的２５０　ｍＬ磨口瓶内（每瓶１只），瓶内盛有１０　ｇ钠石灰以　吸收二氧化碳和水，在瓶口处均匀涂上凡士林密封。　观察并记录小鼠存活时间。　２．４．２亚硝酸钠中毒耐缺氧存活实验　小鼠分组及给药同２．４．１，于末次给药１　ｈ后，　各组动物按２．５　ｍｇ／ｋｇ体重剂量腹腔逐只注射亚硝酸　钠，腹腔注射体积为１０　ｍＬ／ｋｇ，注射后立即用秒表　记录观察动物存活时间。　２．４－３急性脑缺血性耐缺氧实验　小鼠分组及给药同２．４．１，于末次给药１　ｈ后，　各组动物自颈部逐只用颈椎脱臼法断头，立即按秒　表记录小鼠断头后至张口喘气停止的时间【　。　２．５统计分析　采用统计学软件ＳＰＳＳ１　１．５进行数据的统计学　分析，结果用Ｍｅａｎ±ＳＤ表示。选用Ｏｎｅ—ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ结合Ｐｏｓｔ—Ｈｏｃ（ＬＳＤ法）方法进行组问差　异分析。以Ｐ值小于０．０５表示统计学差异显著性。　

３试验结果　３．１最大耐受量试验　以凹叶景天总黄酮的最高混悬浓度（以生药量　计）３０００　ｍｇ／ｍＬ和给药量２０　ｍＬ／ｋｇ进行灌胃给药１　次后连续观察１４　ｄ。给药当天大部分小鼠出现自主　活动减少、懒动、不活跃、有的甚至出现闭目、反　应有些迟钝等现象，但无竖毛、抽搐、翻倒等异常　情况，给药第２天上述症状消失恢复正常。各组小　鼠体重、进食量与正常组相比，无明显差异，排便　正常。试验期间无小鼠死亡。观察１４　ｄ后，小鼠脱　颈椎处死，取各脏器肉眼观察，实质器官大致正常，　无心肺淤血，无肝脾肿大。该试验中，最高浓度凹　叶景天总黄酮无法引起小鼠死亡，因此按凹叶景天　总黄酮最高浓度为昆明种小鼠的最大耐受量（ＭＴＤ）　（以生药量计），即６０　ｇ／ｋｇ。　３．２凹叶景天总黄酮对小鼠出血和凝血时间的影响　与模型组相比，中剂量和高剂量凹叶景天总黄　酮及云南白药显著缩短断尾小鼠出血时间及凝血时　间（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０５；Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０１；Ｐ＜０．０１，　Ｐ＜Ｏ．０１），表明凹叶景天总黄酮具有止血作用，见表１。　

５　第２９卷　文山学院学报　２０１６年第６期　注：与模型组比较，　Ｐ＜Ｏ．０５，“Ｐ＜Ｏ．０１。　３．３　凹叶景天总黄酮对缺氧小鼠存活时间的影响　各剂量凹叶景天总黄酮显著延长亚硝酸钠中毒小鼠　与模型组相比，中剂量和高剂量凹叶景天总黄　的存活时间（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０５　ｏ表　酮均可显著延长常温常压缺氧和急性脑缺血小鼠的　明凹叶景天总黄酮具有耐缺氧作用，见表２。　存活时间（Ｐ＜０．Ｏ１，Ｐ＜０．Ｏ１；Ｐ＜Ｏ．Ｏ１，Ｐ＜０．Ｏ１），　表２凹叶景天总黄酮对缺氧小鼠存活时间的影响（ｎ＝ｌＯ，Ｘ±ｓｄ）　

注：与模型组比较。　Ｐ＜Ｏ．０５，　Ｐ＜Ｏ．Ｏ１。　４讨论　

凹叶景天为景天科多年生草本植物，广泛分布　于陕西、甘肃、河南、江苏、四川、安徽及长江以　南各地区，是土家族常用植物药，称为“岩板还阳”　“马牙半枝莲”［１Ｏ－１２］。除景天科凹叶景天有药用价值　外，同科植物佛甲草也是一种药用植物，具有明显　减慢或阻断心脑缺氧、缺血的病理过程，对脑缺氧　和心肌缺血有改善作用　】。　凹叶景天含有槲皮素、异鼠李素和甘草苷等黄　酮类化合物，其全草各部位总黄酮含量最低的为根，　最高的是花『ｌ４　。黄酮类化合物是多酚大家族的成　员之一，是一类植物次级代谢产物，广泛存在于人　们的日常饮食中，具有抗氧化、清除自由基、抗炎　镇痛、抗肿瘤、护肝和防治心血管疾病等作用［４，１７－２１］。　陈皮黄酮类物质川陈皮素、裸花紫珠总黄酮和柿子　黄酮类化合物均可显著缩短昆明种小鼠断尾出血时　间，裸花紫珠总黄酮和柿子黄酮类化合物有效减短　凝血试验中小鼠的凝血时间【ｚｚ　］。马齿苋乙醇提取　物主要成分为黄酮类化合物和单宁，可提高缺氧小　鼠体内糖酵解过程中关键酶的活性和ＡＴＰ的水平，　具有显著的耐缺氧作用【２５］。黄酮类化合物柚皮素和　槲皮素可显著下调缺氧小鼠大脑中低氧诱导因子、　血管内皮生长因子、活性半胱天冬酶３和泛素的表　达水平，有效缓解缺氧小鼠的脑功能损害【２６］。凹叶