分子生物学实验报告
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RNA提取及RT—PCR[摘要] ：本实验主要是RNA分离与纯化和利用RT-PCR扩增目的基因cDNA。
RNA 的提取主要解决两个问题：第一分离DNA和RNA，DNA和RNA从破碎的细胞中沉淀，利用它们的在盐溶液的溶解度不同达到分离的目的；第二，抑制实验过程中RNA酶，由于RNA酶比DNA酶的活性稳定，实验过程中需要特别的去除RNA酶或抑制其活性。
提取完毕可以用分光光度计进行测定的A260／A280值来判断RNA 的纯度，电泳分析RNA的完整性。
利用纯度和完整性良好的RNA反转录扩增目的基因的cDNA。
RT-PCR的优势在于以mRNA为模板先合成出cDNA，然后以cDNA为模板扩增出不含含内含子的可编码完整蛋白的基因。
因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。
试剂与器材：RNA模板，cDNA引物，反转录缓冲液，dNTP，AMV反转录酶，RNA抑制剂（RNasin），Taq酶，10×PCR缓冲溶液，引物（P1、P2）操作步骤：（1）RNA的提取1.称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到1.5ml离心管中。
2. 加入1 ml Trizol Reagent，15～30℃×5min。
3. 加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15 sec，15～30℃×3min。
4. 冷冻离心12 000 rpm×15min。
5. 将上清液转移到另一个离心管中，加0.5ml预冷异丙醇,混匀，-20℃放置20min。
6. 冷冻离心12 000 rpm×10min，弃上清。
7. 加入0.5ml 70%乙醇于RNA沉淀中并悬浮沉淀，10000 rpm×2min，挥发除去乙醇。
8. 加入30 μl DEPC 处理过的ddH2O溶解RNA。
（2）RNA的反转录①从上述电泳结果中选取电泳结果较好的样品，并从它们相应的试管中取5ul 按12ul体系，再加入6ulDEPC处理过的H2O和1ul oligo primer放入新的离心管中。
②将它们混合后,65℃水浴5分钟，破坏其二级结构，使RNA变性。
③取出离心管，置于冰浴5分钟，然后按下列体系加入试剂：4ul buffer ( 5×) ，1ulRNasin，2uldNTP ( 10mM)，1ulRTase。
④置于 42℃水浴, 1 小时。
然后在70℃水浴中5min，使酶失活，反应终止，得到cDNA 。
（3）PCR 扩增DNA①在灭菌的0.5ml 离心管中，依次加入：15ul 2×Mix ，1ul cDNA ，引物1和2各1ul ，12ul 水，并快速混匀。
②按下面的设置程序进行扩增。
94 ℃ 180s94 ℃ 45s30 cycles: 55 ℃60s 72 ℃ 90s72 ℃ 600s③再用上述PCR 产物取20ul 跑胶。
结果与分析条带模糊不清，说明提取产物量不足。
这个原因可能是：1.在实验操作时，没有严格按照无菌操作，导致所提取的RNA 遭到降解；2.由于RNA 极易被环境中的酶所降解，因此，在提取RNA 时，操作时切勿说话，戴手套操作。
检验RNA 的纯度和完整性 RT-PCR ：右一p38，右二makerDNA提取与酶切[摘要]：本实验主要是提取小麦的DNA及酶切电泳分析。
提取DNA时利用CTAB 可以与与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。
首先通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液，取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。
由于CTAB能溶解于乙醇，在洗涤过程中CTAB即可被除去。
然后对提取的DNA进行酶切出含有内含子目的基因，进行PCR，与p38质粒酶切进行电泳分析比较真核生物内含子在基因中占的比例。
试剂与仪器：1、植物基因组DNA提取，酶切，PCR：小麦幼苗、液氮、抽提液、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、Buffer、BamHI酶、Mix、引物等。
实验步骤：1、植物基因组DNA提取：①取0.15g左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中，加入700μl抽提液（65℃预热）混匀，放入65℃水浴中，裂解40-60分钟，期间温和混匀几次。
②取出裂解好的DNA ，加入700μl 氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀，10000rpm 离心5分钟。
③取上清于新管中（不要混入氯仿），加入700μl （约0.8-1倍）预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃放置半小时以上。
④将析出的DNA 离心，14000rpm，10分钟。
⑤去掉上清，将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，12000rpm离心2min，然后开盖干燥10min，再用100μl水溶解沉淀。
2、基因组DNA酶切、PCR及它们产物的电泳：①酶切反应体系（20ul）：10×Buffer 3ul，DNA 20ul，酶（BamHI）1ul，水6ul；PCR反应体系（30ul）：2×Mix 15ul，基因组DNA 1ul，P1和P2各1ul，水1ul。
②按上述反应体系加入反应物后，1000rpm离心20s混匀，酶切的置于37℃反应4h，PCR的离心管则置于PCR仪进行反应。
③待反应完成后，电泳分析，两种反应产物各点样20ul。
结果与讨论根据电泳条带来看，基因组DNA 的提取情况良好，但酶切效果并不理想。
正常情况下，酶切条带应该呈现分子量不同的多条带，但是我们的结果除了离点样孔附近的地方有亮线外，其他地方都没有明显的条带，还有明显的拖尾现象。
可能原因为：1、提取的DNA 纯度不高，有蛋白质的影响，导致酶切效果不明显，有拖尾现象。
2、加入的酶被污染，或酶切时间过久，导致效果不明显。
左四基因组DNA, 左11酶切GFP的诱导表达[摘要]：本实验通过将制备好GFP质粒导入感受态细胞，在紫外线下可检测目的基因的表达。
利用DNA连接酶将绿色荧光蛋白（GFP）基因与阿拉伯糖启动子连接一起制备质粒载体，将其导入感受态细胞，在紫外线的照射下可以诱导阿拉伯糖的表达，进而观察到绿色荧光蛋白（GFP）基因的表达。
试剂与器材：1、质粒载体和外源DNA的连接反应：P38的扩增引物，T4DNA连接酶，T—easy 载体，Buffer2、感受态细胞的制备及转化：0.1mol/LCacl2，LB液体培养基，氨苄青霉素（100mg/ml），菌液3、阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达：氨苄青霉素，2% 阿拉伯糖，LB固体培养基（添加amp的终浓度为100μg/ml，添加arabinose为培养基的0.2%）操作步骤：1、质粒载体和外源DNA的连接反应按10ul体系添加2×Buffer5ul，PCR产物3ul，T—easy1ul，T4DNA连接酶1.5ul 于1.5ml离心管中，放入离心机中，然后快速离心30s，使反应体系充分混合，室温搁置1h。
2、感受态细胞的制备及转化①分两次将3ml菌液加入1.5ml离心管中，第一次加入后14000rpm离心1min，弃上清，第二次加入菌液600—800rpm离心1min，弃上清。
②用800ulCaCl2将沉淀吹洗成悬液，然后冰浴5min。
③用4000rpm离心10min然后弃上清，再加入200ulCaCl2重悬液体。
④取两支1.5ml离心管，在其中一管中加入之前的连接产物，再在另一管中加入GFP质粒，，然后分别在两管中加入200ul感受态细胞，冰上放置10min。
⑤在42℃水浴中搁置60s。
（热激）⑥在离心管中加入1ml液体培养基，在摇床上摇菌1h。
3、阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达及蓝白斑筛选①溶解LB固体培养基2瓶，待温度适宜后在一瓶中加入氨苄青霉素和阿拉伯糖，另一瓶中只加入氨苄青霉素，然后混匀。
②待凝固前倒平板，冷却后方可使用。
③将转化菌涂在8个LB/amp/arabinose平板上，另外的涂在4个LB/amp平板上。
④在之前的连接产物的离心管中加入6ulIPTG和30ulX—gal，然后涂布在4个LB/amp平板上。
⑤37℃培养16小时。
⑥紫外灯下进行检测。
实验结果及分析阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达实验中，在紫外光照射下，可以看到菌落发出绿色的荧光。
说明装载有绿色荧光蛋白基因GFP的质粒已经成功导入到大肠杆菌细胞中,并在阿拉伯糖的诱导下成功表达。
实验获得成功。
亚克隆摘要：亚克隆是指对已经获得的目的DNA片段再克隆，以便对DNA进行进一步分析或进行重组改造的过程。
本实验是对提取的质粒DNA进行酶切加入外源目的基因，通过蓝白斑方法筛选导入成功的白斑菌落。
首先利用染色体DNA与质粒DNA 的变性与复性存在差异，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，进而经离心使染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，有利于利用DNA连接酶催化DNA片段之间的连接。
最常用的连接酶来源于T4噬菌体的T4DNA 连接酶。
载体与外源DNA的连接是否成功可用蓝白斑筛选。
p38质粒双酶切所得片段PCR扩增做探针，探针进行Southern杂交。
实验材料1、质粒DNA的提取：含质粒的大肠杆菌，溶液Ⅰ（50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH,1% SDS，必须新鲜配制），溶液Ⅲ（pH4.8的醋酸钾溶液），TE缓冲液（pH 8.0），无水乙醇和70%乙醇。
2、质粒P38酶切（30ul体系）：EcoRⅠ酶（1ul），P38质粒（10 ul），buffer（10×，3ul）,水（16ul）3、P38的PCR（30ul体系）：2×Mix（15ul），正向引物P1（1ul），反向引物P2（1ul），P38（1ul），水（12ul）4、质粒载体和外源DNA的连接反应：P38的扩增引物，T4DNA连接酶，T—easy载体，Buffer5、感受态细胞的制备及转化：0.1mol/LCacl2，LB液体培养基，氨苄青霉素（100mg/ml），6、Southern杂交：P38的扩增产物、P38的酶切产物、P38质粒。
DIG RandomLabeling Mix、Anti-DIG-AP Conjugate、BCIP/NBT Stock Solution、Blocking Reagent、20×SSC 0.3M 柠檬酸钠、3M NaCl、2×SSC 0.03M 柠檬酸钠、0.3M NaCl、0.2M EDTA、变性液：0.5N NaoH,1.5M NaCL，中和度：0.5M Tris-HCl,Ph7.4,3M NaCl实验步骤及方法1质粒DNA的提取（P38需菌液3ml，GFP需菌液1.5ul）:①将菌液移入1.5ml 离心管，离心30s（13000rpm），倒去上清液，重复一次，收集3ml 菌液。
