RNA提取及RT—PCR
[摘要] ：本实验主要是RNA分离与纯化和利用RT-PCR扩增目的基因cDNA。RNA 的提取主要解决两个问题：第一分离DNA和RNA，DNA和RNA从破碎的细胞中沉淀，利用它们的在盐溶液的溶解度不同达到分离的目的；第二，抑制实验过程中RNA酶，由于RNA酶比DNA酶的活性稳定，实验过程中需要特别的去除RNA酶或抑制其活性。提取完毕可以用分光光度计进行测定的A260／A280值来判断RNA 的纯度，电泳分析RNA的完整性。利用纯度和完整性良好的RNA反转录扩增目的基因的cDNA。RT-PCR的优势在于以mRNA为模板先合成出cDNA，然后以cDNA为模板扩增出不含含内含子的可编码完整蛋白的基因。因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。
试剂与器材：
RNA模板，cDNA引物，反转录缓冲液，dNTP，AMV反转录酶，RNA抑制剂（RNasin），Taq酶，10×PCR缓冲溶液，引物（P1、P2）
操作步骤：
（1）RNA的提取
1.称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到1.5ml离心管中。
2. 加入1 ml Trizol Reagent，15～30℃×5min。
3. 加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15 sec，15～30℃×3min。
4. 冷冻离心12 000 rpm×15min。
5. 将上清液转移到另一个离心管中，加0.5ml预冷异丙醇,混匀，-20℃放置20min。
6. 冷冻离心12 000 rpm×10min，弃上清。
7. 加入0.5ml 70%乙醇于RNA沉淀中并悬浮沉淀，10000 rpm×2min，挥发除去乙醇。
8. 加入30 μl DEPC 处理过的ddH2O溶解RNA。
（2）RNA的反转录
①从上述电泳结果中选取电泳结果较好的样品，并从它们相应的试管中取5ul 按12ul体系，再加入6ulDEPC处理过的H2O和1ul oligo primer放入新的离心管中。
②将它们混合后,65℃水浴5分钟，破坏其二级结构，使RNA变性。
③取出离心管，置于冰浴5分钟，然后按下列体系加入试剂：4ul buffer ( 5×) ，1ulRNasin，2uldNTP ( 10mM)，1ulRTase。
④置于 42℃水浴, 1 小时。然后在70℃水浴中5min，使酶失活，反应终止，得
到cDNA 。
（3）PCR 扩增DNA
①在灭菌的0.5ml 离心管中，依次加入：15ul 2×Mix ，1ul cDNA ，引物1和2各1ul ，12ul 水，并快速混匀。
②按下面的设置程序进行扩增。
94 ℃ 180s
94 ℃ 45s
30 cycles: 55 ℃
60s 72 ℃ 90s
72 ℃ 600s
③再用上述PCR 产物取20ul 跑胶。
结果与分析
条带模糊不清，说明提取产物量不足。这个原因可能是：
1.在实验操作时，没有严格按照无菌操作，导致所提取的RNA 遭到降解；
2.由于RNA 极易被环境中的酶所降解，因此，在提取RNA 时，操作时切勿说话，戴手套操作。
检验RNA 的纯度和完整性 RT-PCR ：右一p38，右二maker
DNA提取与酶切
[摘要]：本实验主要是提取小麦的DNA及酶切电泳分析。提取DNA时利用CTAB 可以与与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。首先通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液，取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。由于CTAB能溶解于乙醇，在洗涤过程中CTAB即可被除去。然后对提取的DNA进行酶切出含有内含子目的基因，进行PCR，与p38质粒酶切进行电泳分析比较真核生物内含子在基因中占的比例。
试剂与仪器：
1、植物基因组DNA提取，酶切，PCR：
小麦幼苗、液氮、抽提液、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、Buffer、BamHI酶、Mix、引物等。
实验步骤：
1、植物基因组DNA提取：
①取0.15g左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中，加入700μl抽提液（65℃预热）混匀，放入65℃水浴中，裂解40-60分钟，期间温和混匀几次。
②取出裂解好的DNA ，加入700μl 氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀，10000rpm 离心5分钟。
③取上清于新管中（不要混入氯仿），加入700μl （约0.8-1倍）预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃放置半小时以上。
④将析出的DNA 离心，14000rpm，10分钟。
⑤去掉上清，将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，12000rpm离心2min，然后开盖干燥10min，再用100μl水溶解沉淀。
2、基因组DNA酶切、PCR及它们产物的电泳：
①酶切反应体系（20ul）：10×Buffer 3ul，DNA 20ul，酶（BamHI）1ul，水6ul；PCR反应体系（30ul）：2×Mix 15ul，基因组DNA 1ul，P1和P2各1ul，水1ul。
②按上述反应体系加入反应物后，1000rpm离心20s混匀，酶切的置于37℃反应4h，PCR的离心管则置于PCR仪进行反应。
③待反应完成后，电泳分析，两种反应产物各点样20ul。
结果与讨论
根据电泳条带来看，基因组DNA 的提取情况良好，但酶切效果并不理想。正常情况下，酶切条带应该呈现分子量不同的多条带，但是我们的结果除了离点样孔附近的地方有亮线外，其他地方都没有明显的条带，还有明显的拖尾现象。可能原因为：
1、提取的DNA 纯度不高，有蛋白质的影响，导致酶切效果不明显，有拖尾现象。
2、加入的酶被污染，或酶切时间过久，导致效果不明显。
左四基因组DNA, 左11酶切
