山楂总黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性研究

山楂总黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性研究作者：王玉茹李楠来源：《现代食品·下》2017年第07期摘要：本研究通过响应面优化分析，得出山楂总黄酮的最佳工艺条件，并评价其抗氧化活性。

结果表明：最佳提取条件为：液料比42∶1、超声时间20 min、乙醇体积分数52%。

此条件下，山楂总黄酮得率为4.43 mg/g；山楂黄酮对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基有一定的清除作用，呈明显的剂量效应关系，是一种良好的天然抗氧化剂。

关键词：山楂；超声波；响应面；总黄酮；抗氧化Abstract：In this study， the optimal conditions of hawthorn total flavonoids were obtained by the response surface optimization analysis， and the antioxidant activity was evaluated. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows∶ liquid ratio 42∶ 1， ultrasonic time 20 min， ethanol volume fraction 52% In this condition， the yield of total flavonoids of hawthorn was 4.43 mg/g. Hawthorn flavonoids had certain clearance effect on DPPH free radical，hydroxyl radical and ABTS free radicals， and it was a good natural antioxidant.Key words：Hawthorn； Ultrasonic； Response surface； Total flavonoids； Antioxidant中图分类号：R284.2山楂（Crataegus pinnatifada Bge.）又名红果，是蔷薇科山楂属植物的成熟果实，外观呈鲜红色，果皮薄，味偏酸，是药食两用的核果类植物[1-2]。

我国山楂种植面积十分广泛，山楂中含有黄酮、三萜类化合物和有机酸等，一般认为其活性功效多源于黄酮[3]。

黄酮类化合物具有抗氧化功效，能清除体内自由基、延缓衰老、降血脂、降血糖并抑制癌细胞的生长[3-5]。

目前总黄酮的提取方法包括有机溶剂法[6]、微波提取法[7]、超声波提取法[8]、酶辅助提取法[9]和超高压提取法[10]等，其中超声波提取速度快、操作简便、有助于活性成分的保留等，在植物活性成分的提取中应用越来越广泛。

响应面法（RSM）是一种应用较为广泛的方法，实验结果能给出直观图形，还能全面研究各个因素，有效确定各个因子的最佳条件[11-12]。

因此，本实验首先选取液料比、超声时间和乙醇体积分数为影响因子，山楂总黄酮的得率为响应值，利用响应面法优化提取工艺；然后通过对DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基清除率的大小来评价抗氧化活性，以期为山楂总黄酮的开发利用提供参考。

1 材料1.1 原料与试剂山楂（品种：大金星），成熟季节采摘于山西省绛县，立即装入保鲜袋中，置于0 ℃冰箱，备用。

芦丁标准品（上海润捷化学试剂有限公司）；DPPH、ABTS（梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、硫酸亚铁、水杨酸、30%过氧化氢、过硫酸钾，市售分析纯。

1.2 仪器与设备UV-5500 PC紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；KQ-300 GDV数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FA 1604电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；DK-S24电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）。

2 方法2.1 标准曲线绘制以芦丁为标准品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色法制作标准曲线。

参考李利华[13]等人的方法略作修改，取芦丁0.0211 g，50%乙醇溶解并定容至100 mL，得到芦丁标准溶液。

取上述溶液0、1、2、3、4、5 mL分别于10 mL比色管中，加0.3 mL 10% NaNO2，6 min后加0.3 mL10% Al（NO3）3，6 min后加4 mL 4% NaOH并定容至刻度，15 min后在510 nm处测定吸光度值。

以吸光度值为纵坐标，芦丁质量浓度为横坐标，绘制标准曲线（见图1），得方程：Y=0.0064X+0.0303，R2=0.996 86。

实验表明：芦丁质量浓度在21.1～105.5 μg/mL线性良好。

2.2 山楂总黄酮的提取和测定将山楂洗净擦干，去核，用研钵研成浆状，备用。

分别取山楂浆0.50 g，固定提取温度为50 ℃，超声功率为120 W，在设定的液料比、超声时间和乙醇体积分数下提取总黄酮，收集滤液于50 mL容量瓶并定容至刻度线，得到山楂总黄酮试液。

取上述试液2 mL于10 mL比色管中，按照“2.1”的方法测定吸光度值，根据标准曲线方程及公式（1）计算总黄酮的得率。

（1）式中：Z—山楂中总黄酮得率，mg/g；C—山楂总黄酮质量，μg；M—山楂浆质量，g。

2.3 实验设计2.3.1 单因素实验以液料比、超声时间和乙醇体积分数为单因素，研究不同提取条件对山楂总黄酮得率的影响，选取较优的实验条件。

2.3.2 响应面实验根据单因素实验结果，设计响应面实验，因素水平如表1所示。

2.4 抗氧化活性实验按照本实验得出最佳工艺开始实验，所得提取液稀释1倍，即得山楂总黄酮样液，备用。

2.4.1 对DPPH自由基的清除作用参考Mishra[14]等方法，并稍作修改。

取上述样液1、2、3、4、5 mL于试管中，体积不足5 mL的用50%乙醇补至5 mL，得到浓度梯度为4.43、8.86、13.29、17.72、22.15 μg/mL样液。

加入0.2 mmol/mL的DPPH乙醇溶液5 mL，避光反应30 min，波长为517 nm处测吸光度，记为A1，乙醇作为对照测吸光度，记为A0；对DPPH自由基的清除率（%）=（1-A1/A0）×100%。

2.4.2 对羟基自由基的清除作用参考李雅双[15]等的方法，并稍作修改。

按2.4.1方法得到浓度梯度为4.43、8.86、13.29、17.72、22.15 μg/mL样液5 mL。

依次分别加入0.6 mL 25% FeSO4溶液、12%水杨酸-乙醇溶液、12 mmol/LH2O2溶液，混匀，37 ℃反应30 min，用去离子水调零，510 nm处测吸光度，记为A1；用去离子水代替12 mmol/L H2O2溶液重复上述操作，测得总黄酮样品的吸光度值，记为A2；最后用水代替山楂总黄酮样液，测得吸光度值，记为A0；对羟基自由基的清除率（%）=（1-（A1-A2）/A0）×100%。

2.4.3 对ABTS自由基的清除作用参考Ye Chunlin[16]等的方法，并稍作修改，取7 mmol/L ABTS溶液5 mL与88 µL 140 mmol/L K2S2O8溶液混匀，阴暗处反应12～16 h，加入无水乙醇，使其在734 nm处吸光度值为（0.7±0.02），备用。

取样液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，体积不足0.5 mL用50%乙醇补至0.5 mL，得到浓度梯度为0.443、0.866、1.329、1.772、2.215 μg/mL样液。

加ABTS自由基溶液2 mL，6 min后在734 nm处测吸光度，记为Ai；取不同体积样液加入2 mL无水乙醇，测吸光度，记为Aj；取不同体积无水乙醇与2 mL ABTS自由基溶液反应，测吸光度，记为A0；ABTS自由基清除率（%）=（1-（Ai-Aj）/A0）×100%。

2.5 统计分析运用响应面数据处理软件Design-Expert分析实验结果。

3 结果与分析3.1 单因素实验结果3.1.1 液料比对得率的影响按照2.2的方法实验，研究液料比分别为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1时，计算山楂总黄酮的得率。

结果如图2所示。

由图2可知，总黄酮得率随液料比的增加先上升后下降。

在液料比40∶1时，得率最大，为3.59 mg/g；继续增加液料比，得率开始下降，原因可能是此时总黄酮充分溶于乙醇。

液料比在（10～20）∶1，总黄酮没有提取完全，在此基础上继续增加液料比，总黄酮得率明显提高。

3.1.2 超声时间对得率的影响按照2.2的方法实验，研究超声时间分别为5、10、15、20、25 min时，山楂总黄酮的得率。

结果如图3所示。

由图3可知，总黄酮得率随超声时间的延长先增大，后下降。

当超声时间为20 min时，得率最大，即为3.24 mg/g；继续增加提取时间，得率下降。

3.1.3 乙醇体积分数对得率的影响按照“2.2”的方法实验，研究乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%时，山楂总黄酮的得率。

结果如图4所示。

由图4可知，总黄酮得率随乙醇体积分数的增加呈先上升后下降趋势。

当乙醇体积分数为50%时，得率最大，为3.42 mg/g。

继续加大乙醇体积分数，得率有所下降，可能是因为体积分数不同，乙醇溶液极性不同，黄酮提取率不同。

3.2 响应面实验结果3.2.1 响应面优化实验设计以3个单因素为响应因子，总黄酮得率为响应值，设计3因素3水平实验，如表2所示。

3.2.2 回归模型分析响应面回归模型方差分析见表3。

通过数据专家软件8.0.6.1分析结果，得到三个单因素与总黄酮得率Y之间的方程为：Y=4.49+0.14A-0.054B+0.31C-0.085AB-0.10AC+0.052BC-0.34A2-0.75B2-0.92C2。

式中：Y为总黄酮得率，A为液料比，B为超声时间，C为乙醇体积分数。

由表3可知，P液料比>超声时间。

变异系数CV值越小，实验稳定性越好，可信度越高[17]；反之，可信度越低。

本次实验的CV值为2.16%，可信度较高。

3.2.3 等高线与响应曲面图分析图5为等高线和响应曲面图，考察A、B、C三个因素之间的交互作用对总黄酮得率的影响。

由图5可知，AC交互作用的等高线最为接近椭圆，响应曲面坡度最陡，所以AC交互作用对得率影响显著。

三个交互作用对总黄酮得率影响大小依次为AC>AB>BC。

5a 液料比与超声时间的交互作用图5b 液料比与乙醇体积分数的交互作用图5c 超声时间与乙醇体积分数的交互作用图图5 各因素交互作用的等高线及响应曲面图3.2.4 工艺优化及验证实验通过响应面处理软件得到最佳提取条件为：液料比41.93∶1，超声时间19.80 min，乙醇体积分数51.57%，此时山楂总黄酮得率的预测值为4.53 mg/g。