无菌检查方法验证
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无菌检查方法验证：
取本品，分别加灭菌注射用水1ml溶解，采用薄膜过滤法依法检查（中国药典2010年版二部附录Ⅺ H），应符合规定。
菌液制备：10倍稀释法
菌种 培养基 菌悬液制备
枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 营养琼脂培养基 用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌少于100cfu（菌落行程单位）的菌悬液 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 营养琼脂培养基
大肠埃希菌CMCC(B)44102 营养琼脂培养基
生孢梭菌CMCC(B)64941 硫乙醇酸盐培养基
白色念珠菌CMCC(F)98001 改良马丁培养基
黑曲霉菌CMCC(F)98003 改良马丁琼脂斜面培养基 加入5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，再同上制成每ml含菌小于100cfu的菌悬液
菌悬液制备计数结果
菌种 代数 稀释级 菌落数（cfu/ml）
枯草芽孢杆菌 4 10-6 61
金黄色葡萄球菌 4 10-7 89
大肠埃希菌 4 10-6 78
生孢梭菌 4 10-6 67
白色念珠菌 4 10-7 83
黑曲霉菌 4 10-4 40
1、供试品处理
将供试品去掉铝塑盖，外表面用75%酒精全面消毒，然后向每支样品中注入1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液，备用。
2、检查
阳性对照：将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或改良马丁液体培养基管中，在相应的温度下培养。液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5天。观察记录。
阴性对照：将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5天。观察记录。
样品（薄膜过滤法）：每种实验菌取10支处理好的供试品溶液，将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml，用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，将其分为3等份，分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。其中：试验菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的滤膜接种至液体硫乙醇酸盐培养基管中；试验菌为白色念珠菌、黑曲霉菌的滤膜接种至改良马丁液体培养基管中。液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5天。观察记录。
试验结果
菌种 接种管 天数
1 2 3 4 5
枯草芽孢杆菌 1 - +
2 - +
金黄色葡萄球菌 1 - +
2 - +
大肠埃希菌 1 - +
2 - +
生孢梭菌 1 - +
2 - +
白色念珠菌 1 - - - +
2 - - - +
黑曲霉菌 1 - - - +
2 - - - +
阴性对照 硫乙醇酸盐培养基 - - - - -
改良马丁培养基 - - - - - 表中接种管数中1代表用薄膜过滤法接种管；2代表各试验菌不加供试品的阳性对照管。
3、实验结论：含供试品的培养管中微生物生长无微弱、缓慢或不生长，表明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用。
附：试生产三批注射用胸腺五肽（规格10mg）无菌检查原始记录
内毒素测定方法学研究：
取本品三批样品，加0.9%灭菌氯化钠溶液制成0.6mg/ml的溶液，各取适用的家兔3只，共9只，依法测定（中国药典2010年版二部附录Ⅺ D），剂量按家兔体重每1kg注射1ml。
热原检查试验结果
20100401批 20100402批 20100403批
升温℃ 降温℃ 总升温℃ 总降温℃ 总升温℃ 总降温℃ 总升温℃ 总降温℃ 总升温℃ 总降温℃ 总升温℃ 总降温℃
0.43 - 0.92 - 0.31 - 0.91 - 0.45 - 0.95 -
0.26 - 0.39 - 0.26 -
0.23 - 0.21 - 0.24 -
结论：三批供试样品热原检查均符合规定。细菌内毒素检查法是目前控制临床热原反应较为理想的方法之一，同时也是国际上认为较成熟的检测方法，以下对细菌内毒素方法进行验证。
1、材料：注射用胸腺五肽（10mg/支）（自制样品批号：20100401）；鲎试剂（λ为0.25EU/ml，批号0911271）由湛江安度斯生物公司生产，细菌内毒素工作标准品（10EU/支，批号0905210）由湛江安度斯生物公司生产；内毒素检验用水（批号0909240）由湛江安度斯生物公司生产。
2、鲎试剂灵敏度复核试验：将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混合混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿瓶18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。
缓缓倒转180℃观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。
鲎试剂灵敏度复核试验结果
阴性对照 供试品 λC
2λ 1λ 0.5λ 0.25λ
— — + + + + + + + + — — — — — — — — 1λ
结果证明：该鲎试剂的灵敏度为0.25EU/ml。
3、内毒素限值的确定：药品、生物制品的细菌内毒素限制（L）一般按以下公式确定：
L=K/M
L一般以EU/mg表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示，注射剂K=5EU/(kg.h);M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以mg/(kg.h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间按1小时计算。
注射用胸腺五肽依据中国药典2010年版二部附录Ⅺ E内毒素限制（L）每1mg中含内毒素的量应小于3EU，在此基础进行内毒素限制试验，结果如下：
注射用胸腺五肽内毒素限度试验结果
供试品阳性对照 阳性对照 阴性对照 供试品
内毒素限度（EU/mg） 3.0 2.0 1.5 1.0 0.5 + + —
— 3.0 2.0 1.5 1.0 0.5
湛江安度斯生物公司 + + + + + + + + + + — — — — — — + — + +
4、干扰试验
供试品溶液的制备：取供试品加检查用水溶解并按最大有效稀释倍数60倍稀释，制得供试品溶液。
按鲎试剂灵敏度复核试验项操作，按下表制备干扰试验溶液：
干扰试验及结果
内毒素浓度/被加入内毒素的溶液 稀释倍数 内毒素浓度 平行管数 结果
无/供试品溶液 2 — —
2λ/供试品溶液 1 2λ 4 + + + +
2 1λ 4 + + + +
4 0.5λ 4 — — — —
8 0.25λ 4 — — — —
2λ/检查用水 1 2λ 4 + + + +
2 1λ 4 + + + +
4 0.5λ 4 — — — —
8 0.25λ 4 — — — —
无/检查用水 2 — —
Es=1λ在0.5λ～2λ范围内，Et=1λ在0.5 Es～2 Es范围内，证明供试品在稀释60倍后无干扰作用。
注射用胸腺五肽三批中试内毒素检查结果
供试品阳性对照 阳性对照 阴性对照 供试品
20100401 20100402 20100403 + + －－ 20100401 20100402 20100403
+ + + + + + －－ －－ －－
结果表明：注射用胸腺五肽三批中试内毒素检查结果符合规定。
结论：通过对注射用胸腺五肽进行干扰初筛试验和干扰试验，结果证明用细菌内毒素检查法代替热原检查法是可行的，而且具有灵敏、快速等优点，由此可建立该品种的细菌内毒素检查法，细菌内毒素限度定为每1mg样品中内毒素应小于1.5EU。
附：试生产三批注射用胸腺五肽（规格10mg）内毒素检查原始记录
注射用胸腺五肽
Zhusheyong Xiongxian Wutai
Thymopentin For Injection
本品为胸腺五肽与甘露醇等经冷冻、干燥的无菌制品，含胸腺五肽（C30H49N9O9）应为标示量的90.0%~110.0%。
【性状】 本品为白色冻干疏松块状物或粉末。
【鉴别】
（1）取本品，每支加水1ml溶解后，加双缩脲试剂（取硫酸铜0.15g，加酒石酸钾钠0.6g，加水50ml,搅拌下加入10%氢氧化钠溶液30ml，加水至100ml）1ml，即显蓝紫色或紫红色。
（2）在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液的主峰的保留时间一致。
【检查】
酸碱度 取本品，每支加水5ml溶解后混匀，依法测定（中国药典2010年版二部 附录Ⅵ H），pH值为6.5～7.5。
溶液澄清度与颜色 取本品5支，每支加水1ml溶解后，溶液应为澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（中国药典2010年版二部 附录Ⅸ B）比较，均不得更浓。
干燥失重 取本品0.1g，以五氧化二磷为干燥剂，减压干燥至恒重，减失重量不得过5.0%（中国药典2010年版二部 附录Ⅷ L）。
相关多肽 取本品适量，加流动相溶解并稀释成1ml含10mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用流动相稀释成每1ml中含0.1mg的溶液，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液20ul，注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主峰高为满量程的10%～20%，再取供试品溶液20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2.5倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单一最大杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）；各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积的2.5倍（2.5%）。
