无菌检查法及其验证

无菌检查SOP（薄膜过滤法）1.目的为规范无菌检查方法及无菌检查全过程的操作，最大限度防止试验操作过程造成的污染，确保结果准确。

2.范围本SOP适用于生物制品的中间产品（包括原液、纯化产物、半成品、生产中的液体、辅料等）、成品的无菌检查。

只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。

3.定义无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

4.职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行；4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核；4.3.质量总监负责批准本规程；4.4.QA负责本规程执行的监督。

5.引用标准《中华人民共和国药典》2020年版三部6.材料6.1.无菌检查用物品、物料要求：所有物品、物料进入无菌室前，均应经过高压蒸汽灭菌（121℃40分钟，放灭菌指示卡）或180℃干烤2小时或其它经过验证的方法消毒后传入无菌室；如不能用前者消毒方式消毒的物品，须经消毒液浸泡、擦拭后传入无菌室。

6.2.无菌检查环境要求：应在环境洁净度万级下的局部洁净度百级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

6.3.仪器、设备与设施集菌仪、显微镜、台式灭菌器、无菌试验室（万级）、超净工作台（万级背景下的局部百级）：每月环境检测（沉降菌、浮游菌、尘埃粒子）合格后，方可使用。

20-25℃培养房或培养箱、30-35℃培养房或培养箱。

6.4.试验用具：洁净工作服（洁净底服、十万级工作服、万级工作服、鞋套）、工作鞋、口罩及帽子；无菌医用手套或一次性乳胶医用手套：试验前及试验过程中用消毒液浸泡消毒；封闭式集菌培养器（双针头、三联及单针头、三联）：薄膜孔径不大于0.45μm，直径约为 50mm。

根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。

中国药典2020无菌检查法无菌检查法是药品生产过程中非常重要的一项质量控制检测方法，它主要用于检测药品是否受微生物污染，确保药品的无菌状况符合规定的标准。

中国药典2020年版中对无菌检查法进行了详细的规定和说明，本文将对中国药典2020版中关于无菌检查法的要点进行介绍。

一、无菌检查法的概述无菌检查法是指通过将药品接种于特定培养基上，经过一定时间的培养和观察，判断药品中是否存在微生物污染。

它是一种定性的检测方法，可较为准确地判断药品为无菌状态还是受菌状态。

二、无菌检查法的适用范围无菌检查法适用于各类药品的无菌检测，包括注射剂、眼用制剂、气雾剂、洗眼液等。

不同药品的无菌检查方法可能存在一定差异，药企在进行检测时应参照中国药典2020版中的规定进行操作。

三、无菌检查法的操作步骤1. 准备好所需器材和培养基：包括培养皿、无菌针、无菌培养基等。

根据具体的检测要求选择相应的培养基。

2. 无菌操作：操作人员需穿戴无菌手套、无菌帽等无菌防护用品，采用无菌环境进行操作，以尽量降低外界污染。

3. 取样并接种：根据药品的不同形式，采取适当的方法进行取样，并将样品接种于培养基上。

4. 培养和观察：将接种好的培养基置于适宜的温度和条件下进行培养，在规定时间内观察培养皿中是否有微生物生长。

四、无菌检查法的结果解读无菌检查法的结果由操作人员根据培养皿中的生长情况进行判读，一般可分为以下几种情况：1. 无菌：培养皿中无任何菌落生长。

2. 受菌：培养皿中存在微生物的生长，可能意味着药品受到了微生物污染。

3. 有疑似菌落：培养皿中存在一些不明确的菌落，需要进行进一步的鉴定和确认。

五、无菌检查法的注意事项1. 操作人员应严格遵循无菌操作规范，避免外界污染。

2. 选择合适的培养基和培养条件，以确保对不同种类微生物的检测灵敏性和准确性。

3. 对存在疑似菌落的样品进行进一步的鉴定，以确定是否存在真正的微生物污染。

4. 注意培养基的保存和贮存条件，保证培养基的质量和可靠性。

无菌检验——隔离器系统验证USP <1208>Sterility Testing—V alidation of Isolator System/General informance这部分是用于无菌检验隔离器系统的简明验证指南（注意：在这个章节中，“已灭菌”指的是物品或者表面的微生物被清除的状态）在19世纪80年代中期，建立一个无菌检验环境的隔离器就已经开始使用。

隔离器可以通过密封的方法或者采用过滤除菌空气保持正压的方法，创造一个无菌的环境。

当隔离器处于密闭状态时，仅仅能够在隔离器内部和快速传递仓传递物品；当隔离器打开时，允许通过一个特殊设计的并经过验证可以避免污染物进入的开口递出物品。

隔离器采用柔软的塑料（例如聚氯乙烯）、硬塑料、玻璃或不锈钢制造。

由于隔离器系统从根本上避免了分析人员与物品的直接接触，因此在无菌检验操作时可以避免物品和辅助设备被污染。

当隔离器内部与环境完全隔离时，隔离器内部的物品是无菌条件下的传递。

操作者穿着半身衣在隔离器内部进行无菌操作，半身衣是连接在隔离器墙体上的柔软的部分，操作者穿着半身衣有足够的范围在隔离器内部进行操作，操作者也可以通过连接在隔离器墙体上的袖子和手套进行操作。

在隔离器中，不要求操作者穿着特殊的无菌衣进行操作，允许操作者穿着标准的实验室服装进行操作。

为确保隔离器内部无菌。

使用杀孢子剂对隔离器内部进行灭菌处理。

隔离器设计和建造空气处理系统用于无菌检验的隔离器需要配备除菌过滤器（HEPA过滤器是被要求的）。

静态时，要求隔离器尘埃粒子符合美国联邦标准209E的100级空气质量要求（看洁净室微生物评价和其他环境控制《1116》）。

动态时，不要求隔离器符合100级空气质量要求，不要求隔离器内部的空气流速或者空气交换频率。

隔离器系统是要求防止泄漏的，然而，它不是通常意义上的防止隔离器与外界环境进行的空气交换。

当与外界环境直接相连的门打开时，隔离器内部的正压保证隔离器内部的无菌环境不被污染。

备供试品溶液，进样测定，测得样品中芍药苷的平均含量为１ ９８ｍｇ·ｇ－１，计算其ＲＳＤ为０ ５６％。

２ ５　加样回收率２ ５ １　对照品溶液配制：取芍药苷对照品１５ ２６ｍｇ，精密称定，置２５ｍＬ量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为芍药苷加样母液（Ａ）。

２ ５ ２　样品溶液的制备：取９个１００ｍＬ具塞锥形瓶，标记瓶号１～９，分别准确移取１ ０ｍＬ（Ａ）加入到１～３号瓶，准确移取２ ０ｍＬ（Ａ）加入到４～６号瓶，准确移取３ｍＬ（Ａ）加入到７～９号瓶，将１～９号瓶吹干，分别取约０ ６ｇ的样品加入１～９号瓶，按１ ２ ３精密称定之后操作。

表２　加样回收试验结果　（ｎ＝９）项目芍药苷回收量（ｍｇ）芍药苷实际加入量（ｍｇ）回收率（％）平均回收率（％）ＲＳＤ（％）加样回收０ ５倍 １０ ５７５０ ５８０９９ ０８加样回收０ ５倍 ２０ ５８４０ ５８０１００ ５４加样回收０ ５倍 ３０ ５７５０ ５８０９８ ９８加样回收１倍 １１ １５４１ １６１９９ ３８加样回收１倍 ２１ １６２１ １６１１００ ０６９９ ３８０ ７１加样回收１倍 ３１ １４９１ １６１９８ ９４加样回收１ ５倍 １１ ７４１１ ７４１９９ ９６加样回收１ ５倍 ２１ ７２９１ ７４１９９ ２８加样回收１ ５倍 ３１ ７１０１ ７４１９８ １９２ ６　稳定性试验　在“１ ２ １”项色谱条件下，精密吸取供试品溶液５μＬ，注入液相色谱仪，分别于０、２、４、６、８、１２、１６ｈ测定，求得芍药苷峰面积的ＲＳＤ值为０ ２４％。

结果表明，供试品溶液在１６ｈ内稳定。

２ ８　耐用性实验　考察不同色谱柱、柱温、流速对测定方法的影响，芍药苷平均含量为２ ００ｍｇ·ｇ－１，ＲＳＤ为０ ８２％。

２ ９　十批次疏风愈痛丸含量测定结果　测定十个批次疏风愈痛丸中芍药苷含量，测得平均含量为２ ００ｍｇ·ｇ－１，下浮２０％，将芍药苷的限度定为每１ｇ不少于１ ６０ｍｇ，列入含量测定项正文。

无菌检查法，逐字对比20版药典变化无菌检查的定义及无菌检查的适用条件无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器械、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供拭品中微生物的检出。

单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。

培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基商品化的预制培养基。

胰酪胨 1.50g氯化钠 2.5g酵母浸出粉 5.0g葡萄糖/无水葡萄糖 5.5g/5.0g新配制的0.1% 刃天青溶液 1.0mlL-胱氨酸0.5g琼脂 0.75g硫乙醇酸钠 0.5g水 1000ml(或硫乙醇酸）（0.3ml）除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节PH为弱碱性，煮沸，滤清，加人葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节PH, 使灭菌后在25℃的PH值为7.1土0.2。

分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。

灭菌。

2、胰酪大豆胨液体培养基▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化3、中和或灭活用培养基按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌前或使用前加人适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。

4、0.5 %葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化5、胰酪大豆胨琼脂培养基▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化6、沙氏葡萄糖液体培养基▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化7、沙氏葡萄糖琼脂培养基▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化培养基的适用性检查无菌性检查每批培养基一般随机取不少5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。

1101无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。

隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

日常检验还需对试验环境进行监控。

培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。

培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基。

配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。

1. 硫乙醇酸盐流体培养基胰酪胨 15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸 0.5g 新配制的 0.1% 刃天青溶液 1.0ml硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.75g (或硫乙醇酸) （ 0.3 ml) 水 1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH，使灭菌后在25℃的pH值为7.1±0.2。

分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。

灭菌。

在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。

中国药典无菌检查法在当今的医药行业中，无菌检查法是确保药品安全性和有效性的重要手段。

中国药典作为我国药品质量标准的权威法规，对于无菌检查法的规定和实践具有极其重要的指导意义。

本文将详细阐述中国药典中无菌检查法的相关内容，以期为药品生产和质量控制提供有益的参考。

一、中国药典无菌检查法概述中国药典无菌检查法是针对药品中微生物污染进行检查和评估的标准方法。

该方法通过对样品进行适当的处理、培养和观察，以确定样品中是否存在微生物。

无菌检查法对于保证药品质量和安全性具有至关重要的作用，因为微生物污染可能导致药品失效、不良反应甚至危害患者健康。

二、无菌检查法的实践操作1.样品采集与处理在进行无菌检查之前，必须对样品进行适当的采集和处理。

采集的样品应当具有代表性，能够反映药品的整体质量。

处理过程中应避免交叉污染和外界微生物的引入。

2.培养基的选择与制备无菌检查中使用的培养基必须符合中国药典的规定，具有良好的选择性、灵敏度和特异性。

培养基的制备过程需严格按照配方进行，确保质量和稳定性。

3.接种与培养将处理后的样品接种于适宜的培养基中，按照规定的温度和时间进行培养。

接种过程中要保证无菌操作，防止污染。

4.观察与结果判定在规定的培养期结束后，对培养基进行仔细观察，记录任何可见的微生物生长情况。

根据观察结果进行无菌检查的判定，确定药品是否符合无菌要求。

三、无菌检查法的质量控制为确保无菌检查法的准确性和可靠性，必须加强实验室的质量控制。

这包括对实验人员的培训、实验设备的维护与校准、实验环境的监控以及实验过程的规范化和标准化。

同时，应定期进行内部审核和外部质量评估，以确保无菌检查法的执行符合中国药典的要求。

四、结论与展望无菌检查法作为药品质量保证的重要环节，在医药行业中具有举足轻重的地位。

中国药典作为我国药品质量的法规性文件，对于无菌检查法的规定和实践提供了明确的指导。

通过深入理解和严格执行中国药典的相关要求，我们能够更好地保障药品的安全性和有效性，为公众健康事业做出积极贡献。

附录XII A 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在洁净度万级下的局部洁净度百级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

日常检验还需对试验环境进行监控。

无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。

培养基培养基的制备：培养基按以下处方制备，亦可用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。

配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

制备好的培养基应保存在2~25℃避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般可在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。

1、硫乙醇酸盐流体培养基酪胨（胰酶水解）15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0mL硫乙醇酸钠0.5g （或硫乙醇酸0.3mL）琼脂0.75g 水1000mL 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入水葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH值使灭菌后为7.1±0.2。

分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2，灭菌。

在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经1000℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）后，迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。

2、改良马丁培养基胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁0.5g葡萄糖20.0g 水1000mL除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值约为6.8，煮沸；加入putaotang 溶解后，摇匀，滤清，调pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。

无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程中必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

培养基培养基的制备培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。

配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境。

培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。

∙1、硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌气菌）酪胨（胰酶水解）15g；氯化钠 2.5g；葡萄糖5g；新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml；L -胱氨酸0.5g（或新配制的0.2%亚甲蓝溶液0.5ml）；硫乙醇酸钠0.5g；琼脂0.75g（或硫乙醇酸0.3ml）；水1000ml；酵母浸出粉5g除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。

灭菌。

在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。

硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。

∙2、改良马丁培养基（用于培养真菌）胨5g；磷酸氢二钾1g；酵母浸出粉2g；硫酸镁0.5g；葡萄糖20g；水1000ml除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH值约为 6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为 6.4±0.2，分装，灭菌。

无菌检查法包括：直接接种法和薄膜过滤法。

前者适用于非抗菌作用的供试品，后 者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。

操作时，应用适当的消毒液对供试品容器表面或外包装浸没或擦拭消毒后，以无菌 的方法取内容物。

凡无菌检查中，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作阴性对照。

1. 直接接种法 (1) 供试品准备供试品如为注射液、供角膜穿通伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶 液，按表1或表2规定量取供试品，混合。

供试品如为注射用无菌粉末或无菌冻干品或供直接分装成注射用的无菌粉末原料， 按表1或表2规定量取供试品，加入无菌水或0.9％无菌氯化钠溶液,或该药品项下规定的 溶剂用量制成一定浓度的供试品溶液。

供试品如为外科敷料，取供试品4个包装,以无菌操作拆开包装，于不同部位分别剪 取约100mg或1cm×3cm的供试品11份；肠线、缝合线取最小包装5个，拆开包装，共取11 股，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。

供试品如为灭菌医用器具，依样品大小、形状的不同，取供试品11个，接种于足以 浸没供试品的适量培养基中。

或用0.9％无菌氯化钠溶液各40ml，分别冲洗内壁（输血、 输液袋）收集各冲洗液，混合，按薄膜过滤法检查。

供试品如为青霉素类药品，按表1或表3规定量取供试品，分别加入足够使青霉素灭 活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，混合。

亦可按薄膜过滤法检查。

供试品如为放射性药品，取供试品1瓶（支），接种于装量为7.5ml的培养基中。

每 管接种量为0.2ml。

2.操作取上述备妥的供试品,以无菌操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气菌 培养基6管，其中1管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml，作阳性对照,另接种于真菌培 养基5管。

轻轻摇动,使供试品与培养基混合。

需气菌、厌气菌培养基管置30～35℃、真 菌培养基管置20～25℃培养7日。

在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。

阳性对照 管在24小时内应有菌生长，如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7天后,不能从外 观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上 继续培养，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用 接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。