超抗原活化淋巴细胞对喉癌Hep-2细胞系的抑制作用

广东医学２００７年１２月第２８卷第ｌ２塑　

超抗原活化淋巴细胞对喉癌Ｈｅｐ一２细胞系的　

抑制作用术　

吉晓滨　臧林泉　谢景华　胡枫　

广东省广州市第一人民医院耳鼻咽喉科（５１０１８０）；　广东药学院药理学教研室（广州５１０００６）　

【摘要】　目的观察超抗原活化淋巴细胞后对喉癌细胞的抑制作用。方法金黄色葡萄球菌肠毒素Ａ与人　

淋巴细胞混合培养２４　ｈ，激活淋巴细胞，再加入人喉鳞状细胞癌Ｈｅｐ一２细胞混合培养７２　ｈ，通过ＭＴＴ法观察喉癌　

细胞的抑制情况。结果①实验组金黄色葡萄球菌肠毒素Ａ激活淋巴细胞后对人喉鳞癌Ｈｅｐ一２细胞的生长有　

明显的抑制作用，抑制率是４２．６８％，高于对照组４　８２％（Ｐ＜０　０１）。②抑制作用呈现时间的依赖性。③金黄色　葡萄球菌肠毒素Ａ在不同浓度时对喉癌细胞的生长均有抑制作用，特别在浓度是１　ｍｌ、７２　ｈ培养时抑制率最　

高，达８２．８３％。结论超抗原活化淋巴细胞后明显抑制喉癌细胞的生长。　

【关键词】喉肿瘤Ｈｅｐ一２细胞超抗原　

Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｌａｒｙｎｇｅ￣ｃａｒｃｉｎｏｍａ　Ｈｅｐ一２　ｃｅｌｌｓ　Ｊｌ　Ｘｉａｏ—　

ｂｉｎ　ＺＡＮＧ　Ｌｉｎ—ｑｕａｎ，ＸＩＥ　ｊｔｎｇ—ｈｕａ　ｅｔ　ａ１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙａｇｏｌｏｇｙ　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　Ｆｉｒｓｔ　Ｐｅｏｐｌｅ　Ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０１８０，Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ—ｃｔｉｖａｔｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｌａ—　

ｒｙｎｇｅａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　Ａ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｍｉｘｅｄ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　２４　ｈｏｕｍ．　Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ　ＣＯ—－ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎ　ｌａｒｙｎｇｅａｌ　ｓｑｕａｍｏｓｅ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　Ｈｅｐ—－２　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　

２４　ｈｏｕｍ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｌａｒｙｎｇｅａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＭＴｒ　ａｓｓａｙｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ（￣Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｃ—　

ｔｉｖａｔｅｄ　ｂｙ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　Ａ　ｉｎｈｉｂｉｅｔｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｌａｒｙｎｇｅａｌ　ｓｑｕａｍｏｓｅ　ｃｅｉｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　Ｈｅｐ一２　

ｃｅｉｌｓ　ｗｉｔｈ　ａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒａｔｅ　４２　６８％ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒａｌ　ｇｒｏｕｐ　（４．８２％，Ｐ＜０　０１）　②Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｗａｓ　ｔｉｍｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ　③Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　Ａ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎ—　

ｔｒａｔｉｏｎ　ｓｈｏｗｅｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍａｘｉｎｍｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒａｔｅ　ｏｆ　８２．８３％ｗａｓ　ｏｂｓｅ￣ｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　１　ｍｌ　

ｆｏｒ　７２　ｈ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｌａｒｙｎｇｅａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｖｉａ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｌｙｍｐｈｏ—　

ｃｙｔｅｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｌａｒｙｎｇｅａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　Ｈｅｐ一２　ｃｅｉｌｓ　Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ　

喉癌在耳鼻咽喉恶性肿瘤中居第３位，目前处于　

明显增长的趋势，治疗以手术、放疗为主，但对晚期、术　

后严重复发、远隔转移的病例，仍是困扰医生的难题，　

可采用化疗、生物免疫治疗。随着免疫学、肿瘤学的发　

展，认识到肿瘤的发生、发展与人体免疫功能有关。２０　

世纪９０年代提出超抗原的概念。超抗原（Ｓｕｐｅｒａｎｔｉ．　

ｇｅｎ，ＳＡｇ）可高效激活具有杀伤作用的细胞毒性Ｔ细　

胞，并促使释放大量细胞因子，具有抗肿瘤的作用。本　

课题探索超抗原对喉癌的抑制作用。一　

１材料与方法　

１．１　实验材料金黄色葡萄球菌肠毒素Ａ（Ｓｔａｐｈｙｌｏ．　

ｃｏｃｃａｌ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　Ａ，ＳＥＡ）冻干粉剂，１ｍ　瓶，购自军事　

医学科学院微生物流行病研究所。新生小牛血清为美　

国Ｇｉｂｃｏ　Ｃｏｒｐ产品。ＤＭＥＭ高糖培养基为ＧＩＢＣＯ公　

司产品。青霉素及链霉素粉针剂为国产分析纯。ＣＯ，　

培养箱由美国Ｌａｂｃｏｎａ公司生产。ＭＴｒ试剂由Ｓｉｇｍａ　

广东省医学科研基金资助项目（编号：Ａ２００６５０９）；广州市卫生　局医药卫生科技项目（编号：２００５一ＹＢ一０１２）　・１８９７・　

公司生产。人喉鳞癌Ｈｅｐ一２细胞株购自武汉大学中　

国典型培养物保藏中心。　

１．２淋巴细胞的制备取人血１０　ｒｎｌ，用淋巴细胞分　

离液做常规分离。　

１．３人喉鳞癌Ｈｅｐ一２细胞株的培养喉癌细胞接种　

于含１０％小牛血清的ＤＭＥＭ培养液，青霉素、链霉素　

的浓度都是１００　ｍｌ，置于３７￣Ｃ、５％ＣＯ　培养箱中　

常规培养。每２～３天传代１次，取对数生长期细胞。　

１．４实验分组①时间：取２４，４８，７２　ｈ　３个时间点。　

②浓度；实验组ＳＥＡ的浓度分为０．０１，０．０５，０．１，１，　

１０，１００　ｎ　ｍｌ。　

１．５方法用不同浓度的ＳＥＡ与每孑Ｌ　２　Ｘ　１０　淋巴细　

胞混合培养于９６孑Ｌ培养板２４　ｈ，激活淋巴细胞。然后　

加入人喉鳞癌Ｈｅｐ一２细胞接种于培养板，喉癌细胞浓　

度为ｌ　Ｘ　１０　个／ｑ：Ｌ，效：靶比是５：１，共同培养７２　ｈ。对　

照组加入等量的ＤＭＥＭ培养液、相同条件下培养７２　ｈ。　

实验组和对照组每份样品均为５孑Ｌ。然后各孑Ｌ加入　

ＭＴｒ试剂（５　１），每孑Ｌ　１０　】，继续培养４　ｈ后弃去上　

清夜，每孑Ｌ加入二甲基亚砜１５０　ｌ，震荡后室温静置　

１０　ｍｉｎ，

使ＭＴｒ还原产物完全溶解。用酶标仪在波长　维普资讯 http://www.cqvip.com ・ｌ８９８・　

为４９０　ｎｍ处测ＯＤ值。抑瘤杀伤率以下列公式计算：　

抑瘤率＝（ＯＤ对照组一ＯＤ实验组）／ＯＤ对照组×　

１００％。　

１．６统计学处方法采用ｔ检验。　

２　结果　

２．１　ＳＥＡ激活淋巴细胞后对人喉癌Ｈｅｐ一２细胞生长　

的抑制情况实验组ＳＥＡ激活淋巴细胞后，对人喉鳞　

癌Ｈｅｐ一２细胞的生长有明显的抑制作用，抑制率是　

４２．６８％，高于对照组４、８２％（Ｐ＜０．０１）；抑制作用呈　

现时间的依赖性。见表ｌ。　

表１　ＳＥＡ激活淋巴细胞后对人喉癌Ｈｅｐ一２细胞　生长的抑制情况　（ｉ±５）％　

ＳＥＡ的浓度　人喉癌Ｈｅｐ一２细胞生长的抑制率　

（ｎｇ／ｍ１）　２４｝１　４８　ｈ　７２　ｈ　

２．２　ＳＥＡ在不同浓度时对喉癌细胞的生长抑制作用　

ＳＥＡ在不同浓度时对喉癌细胞的生长均有抑制作　

用，特别在浓度是ｌ　ｇ／ｍｌ、７２　ｈ培养时，喉癌细胞的抑　

制率最高，达８２．８３％。见图ｌ。　

一　骆　嚣　荜　罂　暴　

ＳＥＡ（ｐ．ｇ／ｍ１）　图１　ＳＥＡ激活淋巴细胞对喉癌细胞的抑制效应　

３讨论　

３．１　超抗原的概念超抗原是一类细菌或病毒编码　

的蛋白分子，能通过ＭＩＩｃ一Ⅱ类分子的递呈与Ｔ细胞　

受体ＶＢ区结合，而不经过抗原递呈细胞（ＡＰＣ）的内　

处理，高效激活具有杀伤作用的细胞毒性Ｔ细胞，并促　

使释放大量细胞因子。动物实验表明微克水平量可引　

起家兔移植瘤完全消退…。用超抗原诱导免疫细胞的　

杀瘤活性是近年来抗肿瘤生物治疗的研究思路。根据　

抗原与宿主的关系分为两类：①外源性超抗原：为细菌　

毒素，如ＳＥＡ。细菌性ＳＡｇ的共同特点是：细菌分泌　

的、具有水溶性的蛋白质，对靶细胞无直接伤害作用，　ｄｏｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｄｅｃ．２００７，Ｖｏ１．２８，Ｎｏ．１２　

可与ＭＨＣ一Ⅱ类分子结合，活化ＣＤ４　Ｔ细胞。②内　

源性超抗原。　

特点有　：①强大的刺激能力：ＳＡｇ在较低浓度　

（１～１０　ｒｉｇ／ｍ１）就可刺激大部分具有　ｒＣＲ—ＶＢ序列的　

Ｔ细胞增生，被激活的Ｔ细胞可达总数的５％～２０％。　

②无须抗原处理：无须经ＡＰＣ降解处理，而是以完整　

的蛋白质形式直接与ＡＰＣ膜上ＭＨＣ—ＩＩ类分子结合，　

且其结合部位在ＭＨＣ—ＩＩ类分子外侧。③无ＭＨＣ的　

限制性：ＳＡｇ可与ＡＰＣ表面的ＭＨＣ—ＩＩ类分子结合，　

但不受ＭＨＣ—ＩＩ类型的限制，即不论ＡＰＣ与应答细胞　

表达的ＭＨＣ是否同型，Ｔ细胞都接受刺激而增生。④　

选择性结合Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）Ｂ链Ｖ区：ＳＡｇ只选择　

与ＴＣＲＩ３链ＶＢ片段结合。⑤广泛的Ｔ细胞识别特性：　

ＣＩＭ　ＣＤ４５Ｒ　幼稚细胞、ＣＤ４　ＣＤ４５Ｒ一记忆细胞、　

ＣＤ８　细胞都能与表达ＭＨＣ—ＩＩ类分子的细胞所递呈　

的ＳＡｇ起反应，被激活产生大量细胞因子，发挥其效应　

功能。　

３．２超抗原抗肿瘤机制　目前报道用于ＳＡｇ抗肿瘤　

实验研究的肿瘤主要有结肠癌、Ｔ或Ｂ细胞白血病、黑　

色素瘤、神经母细胞瘤、纤维肉瘤、皮肤癌、膀胱癌等，　

超抗原ＳＥＡ用于喉癌治疗的实验，迄今未见报道。本　

课题表明超抗原激活淋巴细胞后对喉癌细胞有明显的　

抑制作用。机制可能有：①ＳＥＡ依赖的细胞介导细胞　

毒作用　一　：是超抗原抗肿瘤的主要作用。直接与　

ＭＨＣ—ＩＩ类分子抗原结合槽外侧非限制性结合，以完　

整蛋白质分子形式被递呈给Ｔ细胞，与Ｔ细胞受体　

（ＴＣＲ）ＶＢ区结合，产生激活作用。激活的Ｔ细胞　

（ＣＤ８　）中杀伤性很强的ＣＴ１　可直接杀伤表达ＭＨＣ一　

Ⅱ类分子的靶细胞，称为ＳＤＣＣ作用。ＳＤＣＣ具有高效　

性和快速性，仅１０　ｍｏｌ／Ｌ浓度的ＳＡｇ就可引起，杀伤　

作用产物释放试验在３０　ｒａｉｎ内就可检查到。它提供　

了快速、高效、特异的消除肿瘤细胞的方法，对不表达　

ＭＨＣ一Ⅱ类分子的肿瘤细胞也可产生间接的细胞毒性　

杀伤作用，即旁观者效应　。　。旁观者效应的发生是　

由于ＳＥＡ使肿瘤微环境从免疫抑制状态转为免疫激　

活状态，引发免疫炎症系统发挥抗肿瘤作用。②由　

ＳＥＡ激活的Ｔ细胞释放多种细胞因子：刺激Ｔ细胞　

（ＣＩＭ　）产生多种细胞因子，如ＩＩ　一１，ＩＬ一２，ＩＬ一６，　

ＩＦＮ一　和ＴＮＦ一　、ｐ这些因子不仅直接杀伤肿瘤细　

胞，还刺激Ｔ细胞进一步增殖分化，产生更多的细胞因　

子与ＳＡｇ依赖的细胞介导的细胞毒共同导致肿瘤细胞　

的溶解，间接参与对肿瘤细胞的杀伤　。其中ＩＦＮ一　

、　ＦＮＦ一　、ｐ是比其它因子具有更重要的肿瘤抑制活　

性　’　。＠ＬＡＫ细胞样细胞毒作用：ＳＥＡ直接、及预