实验二：细菌的简单染色和革兰染色
一、实验目的
1.掌握细菌涂片的制备方法。
2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。
3.巩固显微镜油镜的使用方法。
4.学习无菌操作技术。
二、实验原理
1、染色原理：
细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。
2、革兰染色法原理：
革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验仪器，材料和用具
1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油
、无菌牙签
2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S3
3、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液
四、实验步骤
（1）简单染色
1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。
2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。
3、干燥：涂片后待其自然干燥。
4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。
1 实验三 微生物菌体的革兰氏染色镜检实验
一、实验目的
1．熟练掌握显微镜的使用。
2．掌握单染及革兰氏染色原理及实验技术。
二、实验原理
一般微生物尤其是细菌菌体是无色透明的，在光学显微镜下，细胞体液及结构的折光率与其背景相差很小，因此在普通光学显微镜下难以分辨其细胞结构及形态，菌体染色后与背景的折光指数差异增大，提高了分辨率，增加了细胞的反差，所以就较易观察。
1．单染原理
细菌菌体内含大量蛋白质，蛋白质分子中有羧基及氨基，当在某一pH值溶液中时，蛋白质所带正负电荷相等，此时pH值就称作此蛋白质的等电点。同样，在等电点的pH值时，细菌所带的正负电荷相等。细菌的等电点大约在pH值2~5左右。
当环境pH值比细菌细胞等电点pH值高时，细胞带负电荷，碱性染料（带正电荷）作为阳离子可与带负电荷的细胞结合着色。同样环境pH值比细菌细胞等电点pH值低时，细胞带正电荷，酸性染料（带负电荷）作为阴离子与带正电荷的细胞结合着色。
2．革兰氏染色原理
细菌的等电点大致在pH值2~5之间，由于细菌菌种不同，所以等电点也不同，大致可分为两大类：一类为革兰氏阳性菌，其等电点在pH值2~3之间；另一类为革兰氏阴性菌，等电点在pH值5左右。在这两类之间为一些革兰氏染色不稳定的细菌。
（1）染色作用：初染时结晶紫为碱性染料（着色原理同单染），革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌等电点低，所以在同一pH值时，革兰氏阳性菌所带负电荷比革兰氏阴性菌多，因而革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌摄取结晶紫染料多。
（2）助染作用：碘进入菌体细胞内与结晶紫形成一种不溶于水稍溶于乙醇和丙酮的混合物，碘还能降低细菌的等电点增加摄取染料作用，碘又能与蛋白质中巯基（–SH）作用，帮助染料与菌体蛋白结合。
（3）脱色作用：革兰氏阴性菌细胞壁较革兰氏阳性菌薄，且脂类含量高，当加乙醇时，由于革兰氏阴性菌细胞壁薄，乙醇较易透入，同时乙醇可溶解脂类物质，抽掉革兰氏阴性菌中脂类物质增加了革兰氏阴性菌的通透性，于是革兰氏阴性菌细胞中的结晶紫与碘的复合物较易被抽提出来。革兰氏阳性菌细胞壁较厚而均匀且通透性较小，结晶紫与碘的复合物被保留在细胞内，在同样的时间内不易脱色。
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
实验二 细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
一 目的要求
1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二 实验内容与原理
1．简单染色法原理
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法， 一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、 结晶紫对细菌进行染色。美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检
涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim
2．革兰氏染色法原理
革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。它是细菌学中很重要的鉴 别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G － ）两大 类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检
阳性菌：紫色 阴性菌：红色
革兰氏染色要点： （1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
细菌单染色注意事项
1．涂片取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作，分别挑取金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌于二载玻片的水滴中，调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。
2．干燥于室温中自然干燥。
3．固定涂片面向上，于火焰上通过2—3次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。
4．染色放标本于水平位置，滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。吕氏碱性美兰染色液约染2-3分钟，石炭酸复红染色液约染1-2分钟。
5．水洗染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油镜下观察。
6．镜检按实验程序进行显微镜观察。
