实验三讲义 细菌的染色及形态观察

实验三细菌革兰氏染色及特殊结构观察一、实验目的：1、了解革兰氏染色法的原理，并熟练掌握其操作步。

2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。

3、通过革兰氏染色进一步理解细菌细胞壁的结构特点。

4、巩固在油镜下观察微生物的个体形态。

5、学习并掌握芽孢染色法。

6、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。

二、主要仪器设备及材料：1、菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌斜面2、试剂：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液，香柏油，二甲苯，生理盐水，5%孔雀绿3、仪器与材料：生物显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯，火柴，小试管（75mm×10mm），烧杯（300mL），滴管，接种环，擦镜纸，镊子，电炉三、原理：微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。

因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

它是1884年由丹麦医师Gram创立的。

革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。

细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

微生物学实验(本科生必修课共32学时)教学安排与学时分配每周4学时¾实验1 实验室环境和人体体表微生物的检测¾实验2 细菌形态的观察¾实验3 细菌的简单染色；革兰氏染色¾实验4 细菌荚膜和鞭毛染色；鞭毛运动观察¾实验5 放线菌、真菌形态结构的观察¾实验6 微生物测微技术和计数¾实验7 培养基的制备与灭菌¾实验8 微生物的纯种分离与培养¾实验9 细菌鉴定中生理生化反应¾实验10 噬菌体的效价测定¾实验11 水中微生物的检测（开放实验）¾实验12 产蛋白酶和淀粉酶芽孢杆菌的分离和活力检测（开放实验）¾实验13 微生物多糖——黄原胶的发酵和提取（开放实验）（一）细菌的染色及形态观察(实验3，2)¾认识细菌的基本形态，学习和掌握细菌压滴片的制作方法。

¾学习微生物涂片染色的基本技术。

¾掌握微生物革兰氏染色的基本原理和方法。

¾熟练掌握显微镜(油镜)的使用方法。

¾了解不同的微生物在斜面上、固体培养基和液体培养基中的生长特征。

目的要求实验原理¾微生物的培养特征是指微生物在固体培养基上和液体培养基中生长后所表现出的群体形态特征。

¾不同的微生物有其固有的培养特征，直线接种在固体培养基上培养时，会呈现出丝状，带刺状、小突起状、薄膜状、扩展状等菌苔特征。

¾细菌的个体微小（1～10 μm）¾光学显微镜下可以看到它们的个体形态球形、杆状、和螺旋形等¾染色后的菌体与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

¾简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

¾常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，带正电荷，因此碱性染料很容易与细菌结合使细菌着色。

实验三细菌的简单染色与形态观察实验三细菌的简单染色与形态观察实验三细菌的简单染色和形态学观察一、目的要求：1.了解并掌握简单细菌染色的机理和技术；2.学会用油镜观察细菌细胞的形态。

2、实验材料：1株：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌aureus等培养好的细菌斜面；2.染料：结晶紫3.其他：显微镜、玻片、接种环、酒精灯、无菌水、雪松油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸。

3、基本原则：染色是细菌学上一个重要而基本的操作技术。

因细菌细胞小而且透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及其细胞结构。

用于微生物染色的染料是苯环上带有显色基团和辅助基团的有机化合物。

显色基团决定了化合物的颜色特征，助色基团决定了化合物的成盐性。

染料通常是盐，分为酸性染料和碱性染料。

在微生物染色中，碱性染料更常用，如亚甲基蓝、结晶紫、碱性红、砂黄、孔雀绿等。

简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

此法操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。

常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性和弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料电离后带有正电荷，很容易与菌体结合使细菌着色。

通过本实验，我们可以学习和掌握细菌染色技术，了解细菌细胞的形态，巩固课堂知识，增加感性知识。

四、方法与步骤：（一）制片1.涂片：在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操作从枯草芽孢杆菌从斜面上取少量真菌苔藓，放入水滴中，搅拌均匀，涂膜，涂膜面积约1~1.5cm2。

2.干燥：室温下自然干燥3.固定：手执载玻片一端，使涂菌一面向上，通过火焰2~3次。

此操作也称热固定，其目其主要目的是使细胞质凝固，以固定细胞形状，并使其牢固地附着在载玻片上。

4.染色：将涂片放在水平位置，滴下结晶紫染色液（最好只覆盖涂片），染色1分钟左右。

实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的与要求1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握革兰氏染色法的步骤和关键点3、识别细菌革兰氏染色结果二、实验原理：细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。

为什么要对细菌染色？细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。

简单染色法可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G )和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。

其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。

革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内使细胞呈蓝紫色，而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染后细胞呈红色。

三、实验器材1、菌种 牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h 的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h 的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；2、仪器 显微镜；3、材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。

4、染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液； 细菌的简单染色步骤：细菌的革兰氏染色步骤：涂 片,干 燥,固 定,结晶紫染色,水洗,碘液媒染,水 洗,乙醇脱色,水 洗,番红复染,水 洗,干 燥,镜 检.五、实验关键步骤和注意点：1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。

2、挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。

细菌的革兰氏染色法及形态观察一、实验目的1．了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

2．学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。

二、基本原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。

革兰氏染色属于最重要的鉴别染色。

一般认为革兰氏染色结果的主要原因是由于这两类细菌的细胞壁的结构和化学组成不同。

革兰氏阳性菌细胞壁较厚（20-80nm)，主要成分为肽聚糖，网状结构紧密。

而革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖层较薄（2-3nm)，主要成分是脂蛋白和脂多糖。

细菌经过初染和媒染，在细胞内形成深紫色的结晶紫-碘复合物，当用酒精脱色时细胞壁脱水，阳性细菌细胞壁的肽聚糖层网状结构孔径收缩以至关闭，阻止不溶性复合物结晶紫-碘的逸出，这样使菌体呈蓝紫色。

阴性菌脂类物质溶解，结晶紫－碘复合物随之被洗脱出，用复染剂复染后菌体呈复染后的红色。

三、实验器材1．菌种大肠杆菌、藤黄八叠球菌约24小时营养琼脂斜面培养物。

2．仪器普通生物显微镜显微镜3．材料载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、滤纸、酒精灯、接种环等4．染料草酸钱结晶紫染色液、路哥氏（Lugol）碘液、95％乙醇、0.5 %番红染色液四、实验流程涂片→干燥→固定→初染1min→水洗→媒染1min→水洗→脱色10-30s→水洗→复染1min→水洗→滤纸吸干→镜检。

五、操作步骤1．涂片取洁净的载片一张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一小滴生理盐水，用接种环在火焰旁从斜面上挑取少量菌体与水混合。

烧去环上多余的菌体后，再用接种环将菌体涂成直径1cm 的均匀薄层，以淡淡的乳白色为宜。

制片是染色的关键，载片要洁净，不得玷污油脂，菌体才能徐布均匀。

注意初次涂片，取菌量不应过大，以免造成菌体重叠。

2．干燥涂布后，待其自然干燥或在酒精灯上方稍微加热，切勿靠近火焰。