中国畜牧兽医文摘２０１４年３０卷第８期 基础科学 血凝试验和血凝抑制试验用于禽流感抗体检测 常耀祖杨永春施进文 （宁夏同心县动物疾病预防控制中心，宁夏吴忠７５１３００） 近年来，高致病性禽流感疫情在世界各地均有发生，人感染 高致病性禽流感的事件越来越多。预防高致病性禽流感已成为全 球性的大事。防制高致病性禽流感的主要措施是对禽鸟进行禽流 感疫苗的预防接种，同时，提倡有效免疫，要求免疫的禽只体内 产生足够高的抗体，以抵御禽流感病毒的侵袭。为此，我国各地 的动物防疫监督机构需要对禽鸟进行定期的禽流感疫苗抗体水平 的监测。 对禽流感抗体水平的监测一般采用血凝试验和血凝抑制试验 （ＨＡ—ＨＩ试验），其技术规范依照ＧＢｆｆ１８９３６—２０ｏ３进行。该试验方 法具有经济、操作简便和对抗体水平进行量化的优点，已在各地 动物防疫监督机构和养殖场广泛使用。 １样品的保存 （１）采集的血液样品应及时分离血清，最好分装至离心管 中，标记清楚，离心后吸出血清，对应编号冷藏送检，并禁止运 输过程中剧烈震动。 （２）一般情况下，在５ ｄ内检测的样品可放置在４℃的冰箱 中冷藏，否则，低温冷冻保存。 （３）在检测前血清样品应充分混匀，混匀时采用上下缓慢颠 倒几次的方法即可，切忌剧烈振荡，引起产生气泡及血清中蛋白 变性。 （４）对出现胶胨状的血清样品，可采用反复搅动几下，再离 心的方法有助于缓解该状态。胶状物是含纤维蛋白和纤维蛋白原 的血清，可能是由于放置时间不够，造成血清未完全析出。不建 议直接吸取其中少量的清亮血清。 ２材料准备 检测使用９６￣Ｌ９０。ｖ型微量反应板，要确保每个孔清洁，每 次使用后要立即用清水冲洗孔中的反应物，通过反复试验证明： ９０ｏ ｖ型板相对于１ １０。板及１３０。板来讲，具有红细胞沉降速度 快，产生的凝集图像清晰、结果容易判定等优点。 ３移液枪的使用 （１）单道、多道可调微量移液枪，应选择合适的量程，以便 精确度的提高。 （２）使用时，应采用一档吸液、二档排液的方法。吸取液 体时，枪头要深入液下，缓慢平稳吸液。加缓冲液时，应加在板 孔底部。倍比稀释血清时，应每孔至少反复吹吸６次，以便混合均 匀。注意：尽量避免产生泡沫引起混合不均。加抗原及红细胞时 应在板内液面上方加样，以免交叉污染，影响试验结果。 （３）加样、倍比稀释时，应高度集中注意力，以免漏加、重 复加样等。 ４试剂的保存及配制 （１）禽流感血凝抑制试验所用的抗原、阳性血清应严格按照 说明书的要求进行保存和配置，试验前应提前将其恢复至室内温 度。抗原的保存温度为一２Ｏ℃，反复冻融会降低抗原的滴度，应 避免反复冻融。 （２）ｐＨ ７．２、０．Ｏ１ ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ液的制备： ①应尽量现用现配； ②每次使用前应测ｐＨ值，以免时间过长而导致ｐＨ值发生改 变； ③由于ｐＨ试纸跨度范围偏大，ｐＨ值不易准确界定，最好采用 酸度计准确测量ｐＨ值，以提高试验的精确度； ④全部试验均采用同一种稀释液。 （３）１％红细胞制备的注意事项 ①为避免鸡只红细胞发生自凝现象，在配制１％红细胞悬液 时，最好选择采取２—３只ＳＰＦ鸡，或未进行过任何免疫的成年公 鸡血液。采血的前提条件是要按１／１０采血量的比例在一次性注射 器中加人抗凝剂，如，肝素、枸椽酸钠、柠檬酸钠等。 ②采血完毕后，分装至２ ｍｌ容量的圆底离心管中，因为通过２ ｍｌ与１．５ ｍｌ两种容量离心管相比较，放入１．５ ｍｌ尖底离心管时， 离心后，离心管底部红细胞不易与加入的ＰＢＳ液混匀，易沉积在管 底部，达不到洗脱干净的目的。 ③经２ ０００—３ ０００ ｒ／ｍｉｎ，５ １０ ｍｉｎ，弃去上液和红细胞 上层的白细胞薄膜，再加入１Ｏ倍以上血量的ＰＢＳ液，上下缓匣颠倒 （切忌用力过大使红细胞破裂），使其充分混匀，再离心弃去上 清液，反复几次，直至上清液清亮透明为止。 ④在加红细胞过程中，还须不断轻摇，以确保红细胞均匀， 使其每孑Ｌ加入相同数量的红细胞。 ⑤制备好的红细胞液如果放置后上清液变红，说明有溶血， 不可再使用。 ５抗原液的配制 ①先做血凝试验测定效价，以抗原与红细胞完全凝集的孔为 １ＨＵＡ抗原，配制４ＨＵＡ抗原应往前推算２孔，即除以４后的值。 ②每次做试验前，必须重新检测禽流感抗原的血凝效价，以 免效价发生改变而导致抗原稀释倍数不准确，从而导致试验结果 不准确。 ③为保证配制的抗原准确，还要进行抗原回滴试验。具体方 法：做２排抗原回滴，在２排的第１～８孔各加２５ ｌ ＰＢＳ，取４ＨＡＵ 抗原２５ ｌ加在第２排的第１孔、第２孔，混匀，从第２孔倍比稀 释至第４孔，弃去２５ ｌ 另一排同样。从第２至第８孔补２５ ｌ ＰＢＳ，以保持７５ ｌ总量不变，另一排同样。２排的第１～８孔各加 ２５ ｌｌ％红细胞，震荡１０ ｓ。静置３０ ｍｉｎ观察结果。这样在第ｌ 孔为４ＨＡＵ抗原，第２孑Ｌ为２ＨＡＵ￣原，第３孔为１ＨＡＵ抗原，第４孑Ｌ为 Ｉ￣ＨＡＵ抗原，均为７５ ｌ总量，第５—８孑Ｌ为空白对照。如果抗原回 滴试验不成立，应相应调整抗原浓度直至回滴试验成立。原因： 如果抗原浓度过高，则所测定的抗体效价水平偏低，如果抗原浓 度过低，则所测定的效价偏高。所以不调整抗原浓度至实验成立 的话会对结果有很大影响。 ６结果判定 每次试验必须设阳性及阴性（空白）对照血清，判别试验是 否成立。判读结果时，将酶标板倾斜４５。，以孔底沉淀的红细胞 流动性好，呈泪珠样流淌，边缘无凝集颗粒为凝集完全抑制。 试验器具的清洗每次试验完毕后，应将酶标板中液体甩净， 然后用自来水反复冲净每个孔，再放入３％Ｎ￣Ｈ中４ ｈ，清水反复冲 净，再放人３％ＨＣ１中４ ｈ，清水反复冲净，再用蒸馏水反复冲洗几 次，甩干水分，人干燥箱中干燥备用。实验用烧杯、加样槽、量 筒等也应充分洗净、干燥，以免器具内有杂物、污物以及残留物 从而影响试验结果。 ７体会 在进行禽流感血凝抑制试验时，应充分考虑到各方面的影响 因素，提供的检测结果才会真实可靠，准确掌握禽类的免疫抗体 水平，进而为科学防控禽流感提供理论依据。 ・４５・
hi 血凝抑制试验原理
血凝抑制试验是一种用于检测血浆中抗凝物质浓度的实验方法，也被称为“HI”试验。它是通过观察血浆对于血小板聚集的抑制作用来评估抗凝物质的功能。本文将详细介绍hi血凝抑制试验的原理和应用。
一、原理概述
血液在正常情况下应保持一定的流动性，而不应过于凝结。凝血是一种正常的生理反应，可以防止出血，但如果血液凝结过于剧烈，就会导致血栓形成，从而引发心脑血管疾病等严重后果。为了维持血液的正常流动性，人体内存在一系列的抗凝机制，例如血小板抗凝剂、凝血酶抑制剂等。而hi血凝抑制试验就是用于检测这些抗凝物质的浓度和功能。
二、试验步骤
hi血凝抑制试验主要包括以下步骤：
1. 准备血浆样本：收集新鲜的抗凝血浆样本，避免凝固和溶解物的存在，以确保准确的试验结果。
2. 预处理血浆：将血浆样本进行离心分离，得到上清液，去除红细胞和凝固因子。
3. 加入抗凝剂：将已经预处理好的血浆样本分成若干组，每组加入不同浓度的抗凝剂。
4. 加入血小板悬液：在每组样本中加入一定浓度的血小板悬液，使其与抗凝剂充分混合。
5. 观察血小板聚集情况：将各组样本置于显微镜下观察，记录血小板聚集的程度。聚集程度越低，说明抗凝物质的浓度越高，功能越好。
三、结果解读
hi血凝抑制试验的结果通过观察血小板的聚集程度来进行解读。一般情况下，正常血浆中的抗凝物质浓度较高，能够有效地抑制血小板的聚集，因此血小板聚集程度较低。而当抗凝物质的浓度降低或功能异常时，血小板的聚集程度将增加。通过对不同浓度抗凝剂处理后的血浆样本进行观察，可以得到抗凝物质的浓度和功能信息。
四、应用价值
hi血凝抑制试验在临床上有着广泛的应用价值。首先，它可以用于评估血液的凝血功能，了解抗凝物质的浓度和功能是否正常。其次，对于一些凝血相关疾病的诊断和治疗也具有重要意义。例如，在肝功能不全的患者中，抗凝物质的合成和功能可能受到影响，通过hi血凝抑制试验可以及时发现异常情况并做出相应处理。此外，一些药物的研发和临床使用也需要进行hi血凝抑制试验来评估其对凝血功能的影响。
血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验是目前我
国各地对新城疫、禽流感等疾病进行流行病学
调查、疫病诊断、防疫监测、免疫程序制定等工
作的主要依据，各大型养殖场、兽医门市、畜牧
局、兽药疫苗生产厂家均可以进行操作。该试验
方法具有经济、快速、可靠、操作简便和对抗体
水平进行量化的优点，能够处理大量的样品，并
能在短时间内报告禽类血样的抗体滴度水平。
但是实验用材料不标准、操作不规范等因素也
会影响到试验结果的准确性，导致试验的失败。
笔者就血凝-血凝抑制试验中关键步骤介绍如
下，供同行参考。
1原理说明
某些病毒具有凝聚某些动物红细胞的能
力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验
称为血球凝集试验，以此来推测被检材料中有
无病毒存在，是非特异性的，但是病毒的血凝可
为相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制
实验，具有特异性，通过HA-HI实验，可用已知
的血清来鉴定未知的病毒。
2试验前准备
2.196孔V型微量反应板选用规则标准
的96孔V型微量反应板，V型孔底需光滑明
亮，对底部磨损严重的反应板要及时淘汰。使用
前先用酒精棉擦拭干净，再用蒸镏水反复冲洗
多次，在温箱中烘干备用；使用后及时将反应板用自来水反复冲洗(以孔底不留沉积的红血球
为准)，再将沾有洗涤剂溶液的棉拭刷洗凹孔及
板面，然后再用自来水反复冲净每个凹孔及板
面，待反应板干燥后，放到2％～3％浓度的盐
酸中浸泡24h以上。
2.2待检血清用于分离血清的血液必须是
新鲜无污染的，采集血样后置于硅化管或一次
性塑料离心管内，水平放置，保证血样与空气最
大限度的接触，先置于37℃环境下半小时，再
置于4℃环境下数小时，8000～10000r/min离心
3~5min，将析出的血清移入清洁的包装内备
用。4℃的冰箱中冷藏可保存5d，长时间保存可
冷冻存放，冷冻后会出现蛋白质局部浓缩、分布
不均的现象，在检测前应充分混匀。
2.31%红细胞最好选用健康、未经过疫苗
免疫的成年SPF公鸡，如若没有SPF公鸡也可
以使用低抗体鸡提供的红细胞但需要更多次的
⾎凝、⾎凝抑制试验
红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）
⼀、实验⽤设备：1、离⼼机 1台*（3000转离⼼红细胞）
2、冰箱 1台*（存放抗原）
3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）
4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规⼚家进。
5、96孔V型板稀释⾎清清洗后可重复使⽤
6、⼋道移液器 1把（5-50微升稀释⾎清）
7、吸头和⼋道移液器配套使⽤，清洗后重复使⽤）
8、积液槽配制4个单位抗原及盛放⽣理盐⽔加样⽤
9、⼀次性采⾎管采⾎⽤
10、2毫升注射器采⾎⽤
11、红细胞⾮免疫鸡⼼脏采⾎或免疫鸡也可，但需离⼼5次后使⽤。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂⽤
13、重铬酸钾配制清洁液⽤
14、硫酸配制清洁液⽤
15、吸管 1毫升、10毫升
16、吸⽿球和吸管配套使⽤
17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采⼤鸡）
18、蒸馏⽔当地买。清洗96孔V型板、吸头⽤
19、10毫升离⼼管离⼼红细胞⽤（塑料制）
20、⽣理盐⽔做⾎清稀释液⽤、配制4单位抗原
⼆、实验前的准备：1.抗原：从指定⼚家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：⽤天平称量
3.8克柠檬酸三钠，溶⼊100ml⽣理盐⽔中，待溶解完全后即可使⽤。
3.1％红细胞悬液：由鸡⼼脏或翅静脉采⾎，放⼊加有抗凝剂的离⼼管内（按抗凝剂：全⾎＝1：2的⽐例），迅速混匀。在离⼼机中以3000转/分离⼼5分钟，⽤吸管吸去上清液和红细胞上层的⽩细胞薄膜，将沉淀的红细胞加⽣理盐⽔，慢慢混合均匀，再在离⼼机中3000转/分离⼼5分钟，弃去上清液，再加⽣理盐⽔混匀，如此反复离⼼4～5次，最后⼀次离⼼后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。放⼊4℃冰箱中可保存2—3天。使⽤时⽤1ml 吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加⼊9.9ml的⽣理盐⽔，此即1%红细胞悬液。现⽤现配。4.被检⾎清：每只鸡⼼脏或翼下采⾎0.5-1ml,静置或离⼼，待⾎清析出后备⽤。
5.吸管清洁液的配制：使⽤1%的稀硫酸溶液。⽔10公⽄，硫酸100毫升，将硫酸慢慢倒⼊⽔中，不断搅拌，操作时必须戴⼿套，⼝罩。6.96孔V型板和微量滴头清洁液的配制：重铬酸钾79克，⽔1000ml，硫酸100ml，将重铬酸钾磨碎，溶解于⽔中，然后慢慢加⼊硫酸100ml，不断搅拌，切不可将重铬酸钾⽔溶液倒⼊硫酸中，以防爆炸，操作时必须戴⼿套，⼝罩。7.⾎清稀释液：为灭菌的⽣理盐⽔。
