第八章 哺乳动物基因工程

ESTs的来源

上世纪80年代，对cDNA序列进行大规模测序 的想法就曾提出，但对此一直存在争论，有人认 为这种方法能发现成千上万的新基因；而反对者 则认为cDNA序列缺少重要的基因调控区域的信息。 90年代初Craig Venter 提出了EST的概念，并测定 了609条人脑组织的EST，宣布了cDNA大规模测 序的时代的开始 (Adams et星DNA标记

*指基因组中存在的由2~5个核苷酸为重复 单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复 序列，这种序列广泛分布于真核生物基因 组。由于串联重复序列重复次数的不同就 产生了等位基因之间的多态性
*重复单位是6~100个碱基：小卫星序列 重复单位是100个碱基以上：卫星序列


*由于SSR两端多为相对保守的单拷贝序列， 通过设计引物可以进行PCR扩增

（1）完全的微卫星序列：没有中断的重复序列。如 (CA)25 （2）不完全的微卫星序列：具有一个或多个中断的重复 序列(CA) 9 TA(CA) 9 。 （3）复合的微卫星序列：不同的重复序列被3个以下的非 重复碱基间隔。




(GCGT) 8 NN(GT) 17 。
微卫星序列的多态性程度与微卫星序列的长度成正比关系
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ESTs（Expressed Sequence tags ）是从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆， 从5’末端或3’末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自动测序，所获得的约60500bp的一段cDNA序列。
序列质量检验: Length and quality distribution
Using sequence-tagged sites (STSs) to order overlapping clones (YACs, in this example) into a contig. Five different YACs are tested to determine which STSs they contain (top), and these data are used to assemble a physical map (bottom).

不仅能将目标基因定向引入到其他物种中去 而且可以利用细菌对目的DNA分子进行克隆 基于“遗传重组”技术的生物学的理论不断创新 基于“遗传工程”技术的生物遗传改良成效明显
有关基因工程技术发明获得 Nobel奖
第八章基因工程诞生与发展
基因工程概念
在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的 DNA片段，在体外切割，拼接形成重组DNA，然后将 重组DNA与载体的遗传物质重新组合，
第八章基因工程பைடு நூலகம்生与发展
我是一个实验主义者，我能告诉你的检验 它是否有效的唯一方法就是尝试它。
——保罗·伯格
第八章基因工程诞生与发展
保罗·伯格 Paul Berg
• 保罗·伯格1926年生于美国。 在参加了第二次世界大战 后回到宾夕法尼亚州立大 学学习，1948年获生物化 学学士学位，
• 后在凯斯西部保留地大学 获生化博士学位，1959年 到斯坦福大学任教。
先进入市场。 美国已有40多种基因药物投放市场，主要用于治疗
癌症、血液病、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、细菌
感染、代谢病等疑难病症。
第八章基因工程诞生与发展
美国投放市场的基因药物，1997年超过60亿美 元，且每年以20%的速度增长。
我国也有10多种基因药物投放市场，但大部分基 因药物仍需进口。
因此，基因是企业家的聚宝盆。
因此，他开发了在酶的作用下在试管内将的噬菌体基 因与SV40基因结合在一起的技术。
第八章基因工程诞生与发展
DNA体外重组的创建成功， 是“遗传工程”的奠基之作。
EcoRI
＋
SV40 λDNA
1972. PNAS
David Jackson Robert Symons Paul Berg

2 基因工程的基本原理
A 重组DNA技术的理论基础
19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学 20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 1944年 基因学
艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质DNA 分子遗传学
1953年 1973年
沃森-克瑞克 DNA双螺旋结构
分子生物学
伯格-杰克森-考恩-鲍耶 DNA分子体外拼ห้องสมุดไป่ตู้ 基因工程
1 基因工程的基本概念
B 基因工程的基本定义
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用， 包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的 是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技 术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模 培养以及基因产物的分离纯化过程。
1 基因工程的基本概念
1 基因工程的基本概念
A 重组DNA技术的基本定义
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与 载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受 体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物 或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基 本元件。
2 基因工程的基本原理
D 基因工程的支撑技术
核酸凝胶电泳技术 核酸分子杂交技术 细菌转化转染技术 DNA序列分析技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应（PCR）技术
D 基因工程的基本形式
第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程 第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程 第四代基因工程 基因组或染色体的转移
基因组工程
2 基因工程的基本原理

第八章 基因工程疫苗
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疫苗与基因工程疫苗
传统疫苗（Traditional Vaccine）用人工变
异或从自然界筛选获得的减毒或无毒的活的
病原微生物制成的制剂或者用理化方法将病
原微生物杀死制备的生物制剂，用于人工自 动免疫以保护人或动物产生免疫力，这些制 剂被称为疫苗（多用于预防），即疫苗是由 病原体制成的。
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2、基因工程载体疫苗的设计策略 常用载体： （1）病毒载体 最常用的是痘苗病毒和腺病毒。 痘病毒 优点：宿主范围广，可容纳大分子外源基因，高水平表达 缺点：不能采用口服免疫途径，因此不能形成黏膜免疫。
腺病毒 优点：可经黏膜免疫的理想载体系统
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2、基因工程载体疫苗的设计策略 常用载体： （2）细菌载体 优点：免疫全面，可诱发黏膜、细胞、体液免疫 操作简单，易于实现多种抗原的输送。 缺点：使用原核系统表达抗原，免疫原性可能受到影响。 伤寒沙门氏菌是一种肠道致病菌，其减毒菌株可用于疫苗载 体，能诱导黏膜免疫。 减毒伤寒沙门氏菌 Ty21a缺失了galE基因，细菌表面的Vi抗 原为阴性，而且重要抗原——脂多糖的合成能力下降，为 减毒菌株。 缺点：质粒不稳定，外源蛋白易降解。
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2、 基因工程载体疫苗的设计策略 2.1抗原的选择 2.2载体的选择 基因工程载体疫苗的作用机制是将编码保护性抗原的基 因直接在体内表达，产生抗原，诱导免疫反应。非致 病的细菌或病毒都可以作为疫苗载体。载体的安全性 是需要考虑的首要问题。原因： A. 载体活疫苗不可避免地带有活病毒或细菌一些潜在的 问题。如病毒可能在体内不断地复制其基因组并形成 完整的病毒粒，在繁殖过程中有可能发生突变、自身 修复、或于野生型毒株重组而发生毒力返祖，对机体 构成威胁。
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