第七讲 免疫组织化学染色原理和方法

免疫染色原理与方法的探讨免疫染色原理与方法的探讨一、免疫染色技术的概念和背景免疫染色技术，又称为免疫标记技术，是一种利用抗原和抗体之间的特异性反应，对生物样品中的目标分子进行定位、定量和定性分析的技术。

该技术广泛应用于生物学、医学、药学等领域，是现代生物学研究的重要手段之一。

二、免疫染色技术的基本原理免疫染色技术的基本原理是利用抗原抗体反应的特异性和信号放大效应，实现对目标分子的准确定位和检测。

抗原抗体反应是一种高度特异性的结合反应，抗体只能与相应的抗原结合，从而实现目标分子的特异性识别。

通过标记抗体，可以将信号放大，使目标分子在显微镜下可见，从而实现对其定位和定量分析。

三、常用免疫染色方法及其应用1.免疫组织化学法（IHC）：IHC是将免疫学与组织学相结合的一种染色方法，通过对组织切片进行免疫染色，可以观察到组织中目标分子的分布和表达情况。

IHC广泛应用于临床诊断和病理学研究。

2.免疫细胞化学法（ICC）：ICC是将免疫学与细胞化学相结合的一种染色方法，通过对细胞进行免疫染色，可以观察到细胞内目标分子的分布和数量。

ICC广泛应用于细胞生物学、肿瘤学、血液学等领域的研究。

四、实验操作步骤、注意事项和常见问题1.实验操作步骤：2.（1）样本处理：根据不同的免疫染色方法，对样本进行相应的处理，如固定、包埋、切片等。

3.（2）抗原修复：通过加热、化学试剂等方法使抗原暴露，提高抗体的结合能力。

4.（3）阻断：去除样本中的非特异性抗体结合位点，减少背景干扰。

5.（4）加一抗：将标记抗体的抗体加到样本上，使其与目标分子结合。

6.（5）洗去未结合抗体：通过洗涤去除未结合的抗体，减少背景干扰。

7.（6）加二抗：将荧光标记或酶标记的二抗加到样本上，放大信号。

8.（7）信号检测：根据使用的标记不同，选择相应的检测方法，如荧光显微镜、酶底物显色等。

9.注意事项：10.（1）保持清洁：实验过程中要保持清洁，防止污染。

11.（2）控制温度和时间：抗原修复等步骤需要加热，要控制好温度和时间，避免对样本造成损伤。

免疫细胞化学染色法的原理免疫细胞化学染色法是一种常用的实验技术，用于检测细胞中特定蛋白质的存在和定位。

其原理基于免疫学和细胞生物学的知识，可以通过以下步骤来解释：1. 抗原抗体反应，首先，我们需要选择一个特定的抗体，该抗体能够与我们感兴趣的蛋白质（即抗原）发生特异性的结合。

这个抗体可以是由动物免疫产生的多克隆抗体或单克隆抗体，也可以是经过重组技术获得的单克隆抗体。

2. 细胞固定，接下来，我们需要将待染色的细胞固定在载玻片上，通常使用甲醛或乙醛进行固定。

固定可以保持细胞的形态结构和蛋白质的空间位置。

3. 渗透化处理，为了使抗体能够渗透到细胞内部，我们需要对细胞进行渗透化处理。

一般常用的方法是使用洗涤剂（如TritonX-100）或酸性溶液（如盐酸）来破坏细胞膜，使抗体能够穿过细胞膜进入细胞内。

4. 抗体结合，将选择的抗体加入到载玻片上的细胞上，抗体会与细胞内的特定抗原结合。

这种抗原-抗体的特异性结合可以帮助我们检测和定位感兴趣的蛋白质。

5. 二抗结合，由于直接观察抗原-抗体结合并不容易，我们需要使用一个与第一抗体结合的二抗体。

这个二抗体通常是由动物免疫产生的，可以与多种不同种类的抗体结合。

二抗体通常被标记上一种可视化信号，如荧光染料或酶标记物。

6. 可视化信号检测，根据实验需要，我们可以选择不同的方法来检测二抗体的存在。

如果使用的是荧光染料，我们可以使用荧光显微镜来观察染色结果。

如果使用的是酶标记物，我们可以添加适当的底物，使其产生可见的色素反应。

通过以上步骤，免疫细胞化学染色法可以帮助我们检测和定位细胞中特定蛋白质的存在。

这种方法在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域具有广泛的应用。

（四）IHC的应用
1. 只要是形态科学均可采用:包括病理学、神经科学、 生物学、病原微生物的检测（病毒、细菌、寄生虫 等）、皮肤病学、器官移植等。 2. 可用于多种材料：A.各种组织（冰冻组织、formalin 固定组织、石蜡包埋组织兼可）；B.各种细胞(穿刺、 体液、涂片、血细胞、培养细胞等）。 3. 用于诊断：肿瘤病理学等（大中医院）。 4. 用于科研：临床和基础医学，尤其是形态学专业研 究生常用IHC，或IHC+分生技术；最近几年，分子 生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来， 用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位， 进而深入研究其功能。
1．直接法
荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗 体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察→ 检测抗原。
优点：简单，时间短， 特异性强。 缺点：灵敏度低，所 需抗体量大 （不经济）。 应用：基本不用了！！
2．间接法
荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。 ※显色后镜检
பைடு நூலகம்
特点：1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异性较低；
二、IHC的现状和发展前景
（一）方法学
1.从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）→亲和反应。新的亲 和物质对有：生物素与卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌A 蛋白（SPA）与IgG，凝集素与受体，激素与受体。这些亲 和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、 胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学 （affinity histochemistry），这些方法特异性、敏感性、稳 定性高，更方便、适于某些特殊观察（如EM）。 2.从单一显示某种物质（单标记）→显示多种物质（双标记）。 3.从LM→EM（超微结构）：免疫电镜、胶体金法、金银法。 4.从定性→定量，图象分析（IA）、流式细胞术（FCM）。 5.IHC与ISH相结合，可在不同水平检测DNA、mRNA、protein。 6. 原位PCR+IHC可在组织原位通过扩增检测微量目的DNA。 7. 趋于标准化、自动化。

免疫组化的原理及实验步骤一免疫组化的原理免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。

二免疫组化的实验步骤固定１．浸入式：将组织样本直接放入固定液（4%的多聚甲醛等固定液）内，4℃浸泡2小时，不超过12小时２. 灌注式：主要适用于脑部组织，用从心室灌注生理盐水排空血管中血液后灌注固定液切片1.石蜡切片：(1) 使用从低浓度到高浓度的乙醇使组织脱水；(2)将组织浸入二甲苯中透明；(3)在溶蜡箱中，组织被石蜡包埋；(4)将包埋好的蜡块冷却后固定于切片机上，切成薄片，并将薄片贴于玻片上；(5)用二甲苯脱蜡并重新从高到底浸泡乙醇；注意：石蜡切片制备好后还需要进行抗原修复以解开被甲醛交联的抗原决定簇上的氨基或羧基，常用方法有微波热修复，煮沸热修复，酶消化方法２. 冰冻切片：将固定的组织放入液氮或干冰-丙酮中迅速冷却，然后切片机切片，并将片贴于玻片上封固1.防止脱片，可以使用树脂胶或多聚赖氨酸进行黏附。

2.避免内源性过氧化酶的影响，可以用3%双氧水处理15min,(针对用过氧化酶标记的抗体)3.避免内源生物素的影响，可以鸡蛋清或卵白素进行封闭；4.避免非特异性染色，可以用二抗来源的血清进行封闭染色1.滴加稀释后的一抗，4℃过夜，PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；2.滴加稀释后的二抗，37℃孵育30min,PBS或者脱脂牛奶洗5min 3次；显色：选择与二抗配套的显色系统，进行反应，PBS终止反应后，用苏木素村然胞核，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，37℃干燥48小时，显微镜下观察。