导致黄酒酸败的食果糖乳杆菌的分离、鉴定及其检测条件优化
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※生物工程 食品科学 2018, Vol.39, No.20 161
导致黄酒酸败的食果糖乳杆菌的分离、 鉴定及其检测条件优化
章志超，吴 鑫*，朱应飞（江西省食品检验检测研究院，江西国家果蔬产品及加工食品质量监督检验中心，江西 南昌 330001）
摘 要：为提高黄酒中腐败微生物的检测效率，通过传统培养，结合感官评价和总酸变化对导致黄酒酸败的微生
物进行分析，同时选择性筛选出目标腐败菌ZH-1和ZH-2，经形态学、生化实验和16S rRNA基因鉴定，并进一步采用单因素和Box-Behnken响应面试验设计方法对目标腐败菌的检测条件进行优化。结果表明：黄酒腐败呈浑浊、异味和总酸升高等特点；分离得到的菌ZH-1和菌ZH-2均鉴定为食果糖乳杆菌，该菌是导致黄酒此类酸败的目标腐败菌，表现为在固体培养基上生长缓慢等特点，采用GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》的方法，
需要9～10 d出结果；对食果糖乳杆菌检测方法优化得到最优的培养条件为：在MRS固体培养基基础上，添加质量分数为0.08%的L-Cys，调节pH值为5.4，临用时加入体积分数为9%的无水乙醇，培养温度为30 ℃。采用优化后的方
法，定量检出时间缩短为3～4 d。关键词：黄酒；食果糖乳杆菌；分离；鉴定；优化
Isolation, Identification and Growth Optimization of Lactobacillus fructivorans Causing Rancidity of Chinese Rice Wine ZHANG Zhichao, WU Xin*, ZHU Yingfei(Jiangxi National Center for Quality Supervision and Inspection of Fruits, Vegetables, and Processed Food, Jiangxi Institute for Food Control, Nanchang 330001, China)
Abstract: The aim of this study was to improve the detection efficiency of spoilage bacteria in Chinese rice wine. By using the traditional culture method based on sensory evaluation and the change in total acid, the target spoilage bacteria ZH-1 and ZH-2 were isolated from rancid Chinese rice wine. Furthermore, the spoilage bacteria were identified by their morphological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequencing. Meanwhile, one-factor-at-a-time method and Box-Behnken design with response surface methodology were employed to optimize the culture conditions for the target spoilage bacteria. The results showed that the rancid Chinese rice wine was muddy with an off odor and increased total acidity. Both ZH-1 and ZH-2 were identified as Lactobacillus fructivorans. The spoilage bacteria grew slowly on solid medium, and it took as long as 9–10 days to culture them using the method described in GB 4789.35-2016; the optimal enrichment conditions for detecting L. fructivorans were MRS agar medium containing 0.08% L-Cys with pH adjusted to 5.4, addition of 9% (V/V) of anhydrous ethanol to the medium immediately before use, and culture temperature 30 ℃. The time required to detect quantitatively L. fructivorans using the optimized method could be shortened by 3–4 days.Keywords: Chinese rice wine; Lactobacillus fructivorans; isolation; identification; optimizationDOI:10.7506/spkx1002-6630-201820024中图分类号：TS261.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2018）20-0161-06
引文格式：章志超, 吴鑫, 朱应飞. 导致黄酒酸败的食果糖乳杆菌的分离、鉴定及其检测条件优化[J]. 食品科学, 2018, 39(20): 161-166. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201820024. http://www.spkx.net.cn ZHANG Zhichao, WU Xin, ZHU Yingfei. Isolation, identification and growth optimization of Lactobacillus fructivorans causing rancidity of Chinese rice wine[J]. Food Science, 2018, 39(20): 161-166. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201820024. http://www.spkx.net.cn
收稿日期：2017-07-19基金项目：江西省科技计划项目（20171BBG70073）；江西省食品药品监督管理局科技计划项目（2015SP13）第一作者简介：章志超（1989—），男，工程师，硕士，研究方向为食品质量与安全。E-mail：zhgio2008@126.com*通信作者简介：吴鑫（1981—），男，副主任技师，硕士，研究方向为食品质量与安全。E-mail：jxyjwx@163.com162 2018, Vol.39, No.20 食品科学
※生物工程
黄酒是源于中国的特色古酒，与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒[1]。它是以大米、黍米、粟为主要原料，经加曲、酵母等糖化发酵剂酿造而成的发酵酒，按照产品风格分为传统型黄酒、清爽型黄酒和特型黄酒[2]。它具有乙醇体积分数低、酒性醇厚、营养丰富和风味独特等特点[3]，在日常饮用、烹饪和保健等方面的应用广泛，越来越受消费者的青睐。黄酒由于乙醇含量低，多为开放式发酵，若生产灭菌不彻底、 贮藏或运输过程中容易染菌而发生酸败，主要表现为酒液浑浊沉淀，生酸腐败或白色菌膜形成，甚至异味发臭，严重影响产品质量[4-5]。该问题是我国黄酒行业亟需解决的问题之一。导致黄酒生物性酸败的微生物多种多样，如酵母、醋酸菌、假单胞菌、乳酸菌和芽孢杆菌等[6-10]。目前关于黄酒的国家标准中对黄酒的卫生控制仅限于金黄色葡萄球菌和沙门菌[11]，食品安全抽检项目中也无针对性检测项目及相应的检验方法[12]，食品安全风险显而易见。虽然乳酸杆菌导致的黄酒酸败问题时有报道，但因食果糖乳杆菌导致的黄酒酸败问题则较为少见，按照食品安全国家标准对乳酸菌的检测方法则呈培养周期较长的特点，出现了方法适用性不佳等问题，制约了该菌的检出时效。本研究在通过形态学、生化实验和16S rRNA基因等方法选择性筛选出目标腐败菌——食果糖乳杆菌（Lactobacillus fructivorans）的基础上，针对国标方法的不足进一步采用单因素和Box-Behnken响应面试验对目标腐败菌的检测条件进行优化，大大缩短了该菌定量检出时间，为评估黄酒该类酸败严重程度，解决相关食品安全问题提供了参考。
1 材料与方法1.1 材料与试剂
黄酒，因微生物自然污染，呈浑浊、异味的某品牌黄酒变质样品A和同品牌同批次的质量正常样品B。平板计数琼脂（plate count agar，PCA）、MRS（man rogosa sharpe）琼脂、MRS肉汤、孟加拉红培养基（rose bengal agar，RBA）、结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bile agar，VRBA）、乳酸杆菌生化鉴定套装 北京陆桥生物技术有限公司；其他常规化学试剂均为国产分析纯。1.2 仪器与设备
ZXSD-A1430生化培养箱 上海智城分析仪器制造
有限公司；AW200SG 厌氧工作站 英国Electrotek公司； C1000touch型聚合酶链式反应仪 美国伯乐公司；
BG-Power300型电泳仪 美国Baygene公司。
1.3 方法
1.3.1 总酸的测定
参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》[13]方
法进行测定。1.3.2 菌落计数
菌落总数：参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》[14] 进行测定；大肠菌群：参照GB
4789.3—2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数》
[15]
进
行测定；霉菌：参照GB 4789.15—2016《食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》[16] 进行测定；乳酸菌：参照GB 4789.35—
2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》
[17]
进行测定。
1.3.3 目标腐败菌的分离、鉴定
参照焦唯桢等[18]的方法，对优势菌进行培养，纯化
和镜检，并对分离的纯菌株进行16S rRNA基因鉴定，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序工作，将结果与NCBI中收录的其他菌株序列进行比对分析，并运用 MEGA 5.1软件，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树。
