临床微生物实验室细菌鉴定指南(续)
温州医学院附属第一医院 实验诊断中心
潘钦石
一．细菌的鉴定步骤
1． 鉴定的概念：将一个未知的菌株按其生物学特性，经过与所有已知菌种进行比较后划归到一个已知菌种的分析过程。
2． 对待鉴定的菌种要明确已经获得纯化培养或者该菌种在血平板上生长良好，有单个菌落可以进行生化试验。（我们这里一般都是预先纯化培养）
3． 对待鉴定的菌种进行革兰染色，观察形态（G+c，G–b，G–c，G+b），做触酶，氧化酶实验，然后按科，属，种逐步鉴定。要注意对待鉴定的菌种选择一个合适的鉴定系统，临床常见细菌的快速简单的鉴定系统我们都已经设计好，参考鉴定质控单。
4． 按鉴定质控单的要求填写好病人姓名，年龄，性别；标本类型，标本编号，送检日期等。另外最重要的是要填写好该菌种的菌落形态以及有无溶血。
5． 复习革兰染色，触酶实验，氧化酶实验。
⑴．革兰染色：是细菌鉴定过程中最常用最基本最重要的染色方法。
首先要将待鉴定的细菌涂片，固定（目的：杀死细菌，改变细菌对染料的通透性）。
第一步：以结晶紫初染（染色液Ⅰ）
第二步：以卢戈氏碘液媒染（染色液Ⅱ）
第三步：用95%乙醇脱色（染色液Ⅲ）
第四步：最后用稀释复红复染（染色液Ⅳ）
⑵．触酶实验(H2O2实验)：
a.原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化双氧水生成水和初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。
b.方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在洁净的玻片上涂开，滴加3%过氧化氢数滴，观察结果（立即有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性）。要注意不能在血平板上进行实验，这样易出现假阳性；另外陈旧菌落要是进行实验可能会导致假阴性结果；还有不能在接种针或环上进行实验。
c.阳性对照用金黄色葡萄球菌，阴性对照用链球菌；试剂要避光置4℃冰箱保存。
d.应用：绝大多数含细胞色素的需氧和兼性厌氧细菌触酶实验阳性，链球菌属阴性。临床常见细菌鉴定实验中我们一般用于区别葡萄球菌属（+），微球菌属（+），链球菌属（－）。
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
实验原理：
1、大肠杆菌的性质：
大肠杆菌是G--无芽孢直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。MR试验，吲哚试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S，不能利用枸椽酸盐。半固体中沿穿刺线向四周生长。
2、沙门氏杆菌的性质：
沙门氏杆菌是G-直杆菌。在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产吲哚，不分解尿素。
实验材料：
含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SC）、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油）
实验内容及操作程序：
一、培养基制备：
制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.
二、标本制备：
（1）取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。
（2）用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。
（3）用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37°C恒温培养24小时。
三、细菌分离培养：
（1）取出培养了24小时的麦康凯平板。挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37°C恒温培养24小时。
（2）取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37°C恒温培养24小时。
细菌分离培养与鉴定程序
一、 背景记录
1、猪的临床症状
2、不同猪的发病阶段（早、中、晚、解剖前宰杀还是解剖前已死亡）
3、解剖病变（保存好照片）
二、 分离用培养基
1、常用培养基：鲜血琼脂培养基、巧克力培养基
2、非常用培养基：麦康凯培养基、沙门氏菌选择性培养基
三、 病料的选取和保存
1、首选来自刚宰杀后的活畜禽或死后2-4小时内的畜禽
2、得到病料后应该立即进行细菌分离，分离细菌前最长保存时间（在4℃冰箱内）最好不要超过3-4小时。分离细菌前应将病料保存在4℃冰箱不得放入-20℃冰箱。分离细菌后如需要根据细菌生长鉴定情况来决定病料用途（需再次接种、需再次触片、需接种动物等等）可先将病料暂存4℃冰箱，但不得超过2天。一般情况下分离细菌后应及时将需长期保存的少量病料分装到塑料瓶中进行记录保存，多余的病料进行无害化处理。
四、 分离路线
1、选择分离细菌的目标脏器：
根据疑似疾病和病理变化确定，一般选病变比较严重的脏器做为分离细菌的目标脏器，并选择脏器的病健交界处做为细菌分离的最终部位。一头猪应该选择多个脏器或部位分离细菌。并对不同部位细菌在整个疾病中的作用有一定的评价，如：心血中的细菌多为全身感染分布的病原；关节、肠道、创口、及肺脏则可能只是局部分布的细菌。）
2、分离细菌
一般采用鲜血琼脂培养基划线培养、怀疑存在只能在巧克力培养基上且需要一定二氧化碳才能生长的细菌（如：副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌等）感染时、应同时采用巧克力培养基划线、放到烛缸进行培养。
划线时应该在做到无菌操作的前提下尽量取较大的一块组织或较多量的分泌物、先在培养基表面涂布一小片区域，然后弃去病料再用接种环从涂布区域开始进行划线。这样一方面可保证分离到病料中的细菌，另一方面也能保证长出单个菌落为进一步鉴定提供方便，同时也为评价病料中细菌含量及不同细菌数量比例的评价提供依据。
如果病料来自病程较长或死亡动物且细菌种类复杂、难以确定病原菌的情况下、可考虑分离细菌的同时取病料接种小鼠、再从小鼠分离细菌，二者互为参考。
分离鉴定粪便中的大肠杆菌的实验流程
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实验流程：分离鉴定粪便中大肠杆菌的方法
