第八章 分子标记及其应用
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第八章 分子标记及其应用
1) 分子标记的种类与特点
1. 遗传标记的种类与特点
遗传标记：指可以稳定遗传的、易于识别的特殊遗传多态性形式。
Minisatellites：小卫星序列
遗传标记的种类与特点
1）形态标记：肉眼可见的特征性状，简单实用，但数目少，受发育阶段与环境影响。
2）细胞标记：染色体核型与带型，受环境影响小，稳定可靠，但耗时耗力，信息量不足。
3）生化标记：贮藏蛋白、同工酶等，信息量较大，取材方便，但不能反映基因组非编码区信息，仍受发育阶段与环境影响。
4）DNA分子标记：基因组DNA 水平的变异，理想的遗传标记。
2. DNA分子标记
DNA分子标记：简称分子标记，指基因组DNA 水平上的任何差异，来自缺失、插入、置换、颠换、重复等，通常以分子杂交或凝胶电泳图谱的形式体现。
2.1 分子标记的优点
1）数量多，遍及整个基因组，理论上检测位点近乎无限；
2）稳定遗传，不受环境、发育阶段和是否表达等限制;
3）多态性高，自然存在，无须专门创造；
4）表现为“中性”，即不影响性状的表达；
5）许多为共显性，能鉴别杂合与纯合，提供完整的遗传信息。
2.2 分子标记的类型
分三大类:
1) 基于核酸分子杂交: 第一代，1980s, RFLP（Restriction fragment length
polymorphism ），限制性片段长度多态性
2) 基于PCR或限制酶切+PCR: 第二代，1990s ,RAPD、AFLP、SSR、ISSR、 SCAR、STS等
3) 基于DNA测序: 第三代，近年来SNP和EST,反转录转座子等
第三节 分子标记的应用
1. RFLP标记
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)：限制性片段长度多态性，1980，Botstein。
基本原理：不同基因组DNA经特定限制酶消化后产生大小不等的片段，再经电泳分离、Southern 印迹杂交和检测后，得到特异的RFLP 标记，它反映不同DNA对所用探针限制性酶切片段长度的多态性，实际是酶切位点的变化和分布情况。
关键因素：
限制酶：用一种酶切产生的多态性有限，常用6~8种酶来筛选多态性。
探针：常用单拷贝或低拷贝 gDNA或cDNA克隆，否则条带模糊（smear），不易观察。
RFLP标记的优缺点
优点：
1）共显性；
2）存在于整个基因组，位点数不受限制，常可检测到1~4个基因座；
缺点：
1）筛选多态性探针较困难，需一系列探针；
2）DNA样本量要求大，操作较繁杂，耗时费资，同位素污染，现已发展地高辛等标记。
2. RAPD 标记
RAPD (Random amplified polymorphic DNA)：随机扩增多态性DNA。1990年提出。
基本原理: 单引物PCR标记 ；不同基因组DNA在随机引物Arbitary primer
（8~10bp）结合位点以及2个结合位点之间的距离可能不同，导致扩增片段数目和长度不同，经电泳分离显示出来，反映基因组相应区域DNA的多态性。 步骤：退火温度36℃左右，其余同普通PCR。
RAPD 标记的优缺点
优点：
1）简单快速，模板用量少，无需同位素；
2）无需基因组序列信息，引物通用；
3）成本低。
缺点：
1）显性标记，不能鉴别杂合子与纯合子；
2）稳定性和重复性较差；受很多因素影响： 退火延伸温度，模板浓度，Mg2+浓度，试剂污染，应舍重复
3）序列不同但长度相同的片段共迁移，使多态性检测受限制.只能分开片段长度不同的dna片段，对于长度相同但碱基组成不同的就分不出来
3. AFLP标记
AFLP (Amplified fragment length polymorphism)：扩增片段长度多态性，1992 年提出，RFLP与PCR相结合的产物。
基本原理: 基因组DNA限制酶切（1种为常见6碱基切点，另1种为4碱基稀有识别位点，常为EcoRI（6）/MseI（4） ），酶切后DNA片段连接双链人工接头（14~18bp，核心顺序+限制酶识别序列，随机设计 ），以接头和相邻的限制酶位点作为引物结合位点，进行 双引物PCR扩增，产物用高分辨力测序胶分离。此多态性主要来自引物3`端选择性核苷酸的变化。
AFLP关键技术：引物的设计与组合。
引物由三部分组成:
1) 5`端与人工接头互补;
2) 中间部分与限制酶识别位点互补;
3) 3`端为1~3个选择性核苷酸。
AFLP 图谱
常用2~3个选择性碱基，每个泳道50~100条带
AFLP标记的优缺点
优点： 1）兼具PCR的高效性与RFLP的准确性；
2）常扩增50~100条带，多态性高，信息量大；
3）通过设计不同接头就可得到不同的引物，无需基因组序列信息。
缺点:
1）步骤多，流程长，重复性不够好；
2）需放射性同位素或荧光素等标记引物，但目前已发展银染技术；
3）显性标记。
4. SSR标记
SSR（simple sequence repeat）：简单序列重复，也称微卫星 (microsatelite) DNA，真核基因组中普遍存在，随机分布，主要位于非编码区；重复单元2~5 bp，串联重复10~60次，多态性主要来自串联重复次数的不同。
SSR标记的原理: 不同基因型某一特定位点的SSR长度不同, 但其侧翼序列往往是保守的单一序列，据此侧翼序列设计双引物，经PCR扩增即可得到长度不同的SSR片段，产物经PAGE或高浓度琼脂糖凝胶电泳，即可显示不同基因型在此位点的多态性。
注：一般检测的是单一位点的复等位基因，农作物中多数SSR位点的复等位基因数多达十几甚至几十个，多态性高。
SSR侧翼序列的获得：
（作为设计引物的模板）
一般程序：
1）建立基因组DNA的质粒文库；
2）根据预得到的SSR类型设计并合成探针，如预获得(AT)n/(TA)n，则合成(AT)n探针；
3）用探针筛库，获得阳性克隆；
4）对阳性克隆DNA插入序列进行测序。
SSR标记的优缺点
优点：
1) 序列短， 多数小于200bp，易扩增；
2) 有高度多态性，信息量大； 3) 共显性。
缺点：
须获得侧翼序列设计引物，步骤多、费用高；
引物具有物种特异性。
5. SNP标记
SNP (single nucleotide polymorphism)：单核苷酸多态性，指不同基因组DNA中某一特定位置上单个核苷酸的差异，包括单碱基的转换、颠换、插入和缺失等，而且其在群体中出现的频率大于1%（如低于1%，则视为点突变，不可能作为标记）。
SNP的分布与遗传效应
1）分布于编码区：即cSNP，功能性变异，可能会影响蛋白产物的氨基酸序列和功能。
2）分布于非编码区：即调节区/基因周边SNPs，可能影响基因的表达水平。
SNP是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素，有些疾病和性状与SNP有关，如人镰刀型细胞贫血症。
SNP的检测方法：
有近百种，包括杂交法、熔解法、电泳法、酶学法、化学法、物理法、测序法（最直接）以及它们的组合方法，综合利用纳米材料技术、多重PCR技术、各种荧光探针设计技术和各种荧光标记技术等。
DNA芯片技术在高通量检测SNP方面显示出独特的优势，最理想、最具有发展潜力，但仍存在成本高、重复性不够好等问题。
SNP标记的优缺点
优点：
是覆盖全基因组、标记数量最大，多态性最高的标记，
缺点：
SNP技术主要建立在基因组测序基础之上，尚难在未测序生物上应用。
6. ISSR
ISSR：（inter-simple sequence repeat, ISSR）：区间-简单重复序列。以加锚SSR寡聚核苷酸作引物，对位于反向排列的SSR之间的DNA序列进行扩增，而不是扩增SSR本身，反映SSR区间多态性。
ISSR引物设计：简单，无需知道DNA序列，长度16~18bp，由1~4bp组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，用以扩增两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列，只有与锚定碱基互补的位点才被靶定，提高了扩增的转一性。单引物PCR标记。
7. SCAR
SCAR（sequence characterized amplification region）：特异序列扩增区域标记。
在对基因组DNA做了RAPD分析后，将目标RAPD片段克隆并进行末端测序；再根据2端序列设计特异引物，即前10个碱基应包括原来的RAPD引物；用此引物对基因组DNA再扩增，即可将与原来RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。
8. STS
STS（sequence-tagged sites）：序列标签位点/序标位，是对以特异引物序列进行
PCR扩增的一类分子标记的总称，用来扩增、分析基因组中特定区域的多态性
第三节 分子标记的应用
1. 分子遗传图谱的构建
经典遗传图谱：通过遗传重组分析，将基因或形态、生理和生化等常规标记在染色体上线性排列；标记数量少，图距大，饱和度低，应用价值有限。
分子标记遗传图谱：构建原理同上，利用DNA分子标记作图，高密度图谱。
已构建拟南芥、水稻、小麦、玉米、大豆等高密度分子遗传图谱，极大地促进了基因定位与克隆、物理图谱的构建和分子标记辅助选择育种等。
2. 基因定位与克隆
2.1 基因定位
质量性状基因定位：常用近等基因系 (NIL，near isogenic lines )分析法和分离集团混合分析法 (BSA，Bulked segregation anlysis)。
近等基因系：是指两个或多个形态上相似，，遗传背景相同或相近，只在个别染色体区段上存在差异的遗传材料，通过杂交和回交获得。
