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银杏叶多糖的分离纯化及鉴定
黄桂宽;李毅
【期刊名称】《中国生化药物杂志》
【年(卷),期】1996(017)004
【摘要】银杏叶经水提、醇沉等得到银杏叶多糖（ＬＧＢＰ）。
将ＬＧＢＰＨＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００层析柱，分离得到ＬＧＢＰ－Ａ和ＬＧＢＰ－Ｂ两种多糖，经电泳与凝胶柱柱层析鉴定均为单一多糖。
平均分子量分别为１１×１０＾４和２×１０＾４。
经纸层析与高效液相色谱证实其单糖组成分别是：ＬＧＢＰ－Ａ：Ｄ－葡萄糖，Ｌ－鼠李糖、Ｄ－木糖；ＬＧＢＰ－Ｂ：Ｄ－葡萄糖。
【总页数】3页(P157-159)
【作者】黄桂宽;李毅
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R914.1
【相关文献】
1.银杏叶水溶性多糖的分离、纯化、初步鉴定及活性研究 [J], 杨静峰;张旭;梁忠岩;张丽霞
2.银杏叶提取物中染料木素的分离纯化及结构鉴定 [J], 王凤芹;蒋可志;李祖光
3.安徽产地桑叶多糖分离纯化、结构鉴定与抗氧化活性研究 [J], 圣志存; 陈晓兰
4.胶红酵母Rhodotorula mucilaginosa CM-1菌株的鉴定及胞外多糖的分离纯化[J], 马文锦;李梅林;王博;周彦兵;张永显;于长青;彭涛
5.植物多糖提取、分离纯化及鉴定方法的研究进展 [J], 陈红;杨许花;查勇;宋礼;高丹丹
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山东畜牧兽医 2019年第40卷4硫酸化银杏叶多糖的制备及对犬细小病毒疫苗免疫增强作用的研究桑浩田† 于忠芳† 于成龙 张崇昊 董鹏飞 闫振贵*（山东农业大学动物科技学院 山东 泰安 271000）摘要 本研究通过水提醇沉淀法从银杏叶干粉中提取粗多糖，经脱色素、除蛋白等处理得到精制银杏叶多糖，利用氯磺酸—吡啶法制得硫酸化银杏叶多糖，其多糖含量为68.6%，蛋白含量为2.59%，硫酸基含量为16.4%，硫酸基取代度为1.74；通过犬的体内免疫实验，研究硫酸化银杏叶多糖对犬细小病毒活疫苗免疫反应的影响。
结果表明，硫酸化银杏叶多糖能够不同程度的提高免疫后血清CPV 抗体水平和IL-2的含量。
由此表明，硫酸化银杏叶多糖对犬细小病毒活疫苗具有免疫协同作用，这为硫酸化银杏叶多糖作为免疫增强剂的开发奠定了试验基础。
关键词 硫酸化银杏叶多糖 犬细小病毒 抗体水平 免疫增强中图分类号：S816.76 文献标识码：A 文章编号：1007-1733(2019)12-0004-03 犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine-Parvovirus ，CPV) 感染引起的高度接触性传染病，主要引起犬急性出血性肠炎或新生犬急性心肌炎，对养犬业危害巨大[1]。
目前，针对犬细小病毒病尚未发现非常有效的治疗方法，主要依靠接种弱毒疫苗来预防该病[2]。
但是，弱毒疫苗常因母源抗体干扰、免疫原性不强、免疫程序不合理等因素影响导致免疫效果不理想。
为此，本试验试图从寻找新型的免疫增强剂为突破口，探索硫酸化银杏叶多糖对犬细小病毒弱毒疫苗的免疫协同作用。
随着近几年对多糖研究的不断深入，作为银杏叶提取物的银杏叶多糖(Ginkgo biloba leaf polysaccharide ，GBLP)，其生物学活性也引起了研究人员的浓厚兴趣。
银杏叶多糖是从银杏叶中提取出来的水溶性成分，主要由半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖醛酸等单糖以α-糖苷键形式连接聚合而成，现已证实其具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性。
天然植物多糖及复合多糖的研究进展一、概述天然植物多糖，作为一类由多个相同或不同的单糖分子通过糖苷键连接而成的复杂高分子化合物，广泛存在于自然界中的各类植物之中。
这类天然高分子化合物不仅作为植物的贮藏养料和骨架成分，更因其独特的生物活性，在食品、医药、保健品等多个领域展现出广泛的应用前景。
随着人们对健康生活的追求以及对天然、绿色、安全产品的日益青睐，天然植物多糖的研究逐渐受到广泛关注。
大量研究表明，植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、降血脂等多种生物活性，且其毒性相对较小，因此在预防和治疗疾病方面显示出独特的优势。
与此复合多糖的研究也取得了显著进展。
复合多糖是指由两种或多种不同来源、不同种类的植物多糖经过特定的组合和制备工艺而得到的一类多糖混合物。
相较于单一来源的多糖，复合多糖在生物活性、作用机制以及应用范围等方面均表现出更为优越的性能。
通过科学合理地组合不同种类的植物多糖，可以实现对多糖生物活性的协同增效，从而进一步提高其在医疗保健、功能性食品等领域的应用效果。
对天然植物多糖及复合多糖的研究不仅有助于深入了解其生物活性及作用机制，更可以为开发新型、高效、安全的医疗保健和功能性食品提供重要的理论依据和实践指导。
本文将对近年来天然植物多糖及复合多糖的研究进展进行综述，以期为该领域的未来发展提供有益的参考和启示。
1. 天然植物多糖概述天然植物多糖是一类广泛存在于自然界中的复杂生物大分子，由许多相同或不同的单糖分子通过糖苷键连接而成。
这些多糖具有独特的链状结构和空间构型，赋予了它们丰富的生物活性与功能。
植物多糖在植物体内扮演着多种角色，包括作为能量储存、结构支持以及参与细胞间的信号传递等。
天然植物多糖的种类繁多，根据单糖的组成和连接方式的不同，可分为同多糖和杂多糖两大类。
同多糖由相同的单糖分子组成，如淀粉、纤维素等，它们在植物体内大量存在，是植物的主要能量来源和结构成分。
而杂多糖则由不同的单糖分子组成，其结构更为复杂，可能还包含与蛋白质或核酸的结合部分，形成结合型多糖。
银杏多糖的研究进展仰榴青１，徐佐旗２，吴向阳２，刘 倩２，陈 钧２，刘 洁２（１．江苏大学药学院，江苏 镇江 ２１２００１；２．江苏大学生物与环境工程学院，江苏 镇江 ２１２０１３）摘 要：银杏多糖是一类具有重要生理和药理活性作用的功能活性成分，是目前研究的热点之一。
本文对银杏多糖的提取、分离纯化、定性定量分析、活性研究和临床应用等最新进展进行综述，并指出存在问题和今后研究的主要方向。
关键词：银杏；多糖；综述Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ＬＹＡＮＧ Ｌｉｕ－ｑｉｎｇ１，ＸＵ Ｚｕｏ－ｑｉ２，ＷＵ Ｘｉａｎｇ－ｙａｎｇ２，ＬＩＵ Ｑｉａｎ２，ＣＨＥＮ Ｊｕｎ２，ＬＩＵ Ｊｉ１（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｊｉａｎｇｓｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ， ２１２００１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ， ２１２０１３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ Ｌ ａｒｅ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｗｈｉｃｈ ｈａｖｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ， ａｎｄ ｔｕｒｎ ｉｎｔｏ ｏｎｅ ｏｆ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｆｏｃｕｓｅｓ． Ｔｈｅ ｌａｔｅｓｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ， ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ， ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａＬ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｔ ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａＬ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｐｕｔ ｆｏｒｗａｒｄ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ Ｌ；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｓｕｍｍａｒｙ中图分类号：Ｒ２８４．２；Ｒ２８５．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００４）１１－０３７２－０４收稿日期：２００４－０７－１２作者简介：仰榴青（１９６５－），女，副教授，博士，主要从事天然产物化学和中药新药开发研究。
银杏是世界上珍贵的药用植物，其叶、果和外种皮等皆具有药用开发价值，被称为“全身都是宝的活化石”。
由银杏叶开发而成的银杏提取物（ＥＧｂ）及其制剂是目前深受人们欢迎的天然药物之一，由白果开发而成的各种营养食品也很多［１］。
然而目前对银杏的研究主要集中于黄酮和内酯类化合物，对其他活性成分研究较少。
植物多糖是当今研究的热点之一，研究发现银杏多糖具有多种活性，有重要的研究和开发应用价值。
为此笔者对银杏多糖的研究现状进行综述，为银杏多糖的进一步开发利用提供参考。
１银杏多糖的提取多糖的提取通常采用水煮醇沉的常规方法。
银杏（包括银杏叶、白果和外种皮）中多糖提取一般先用石油醚脱脂，再经热水提取乙醇沉淀得多糖。
多糖加水复溶，透析去除小分子化合物，再去蛋白、醇沉可得粗多糖。
１．１银杏叶多糖（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｌｅａｖｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ＧＢＬＰ）的提取［２～６］１００ｇ烘干粉碎银杏叶于索氏提取器中用石油醚（沸程３０～６０℃和６０～９０℃）连续抽提至无色［２］，风干后分三次加入３０００ｍｌ水，９０℃浸提６ｈ。
合并滤液，９０℃恒温蒸发浓缩至过滤液原体积的３０％。
浓缩液３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，上清液加入３倍体积９５％乙醇沉淀多糖。
多糖沉淀加水复溶，透析、Ｓｅｖａｇ法去蛋白。
样液再以４倍体积９５％乙醇沉淀多糖，最后经无水乙醇脱水，丙酮、乙醚洗涤，得灰白色银杏叶多糖粉末，得率２．４％。
黄桂宽［３，４］、靳菊情［５］和Ｊｏｓｅｆ Ｋｒａｕｓ［６］也用水提醇沉法得到了银杏叶多糖，文献［６］报道多糖得率为１．１％。
１．２银杏白果多糖（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｓｅｅｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＧＢＳＰ）的提取［７～９］２００ｇ银杏白果，粉碎后分３次加入３０００ｍｌ水，７５℃浸提８ｈ。
合并滤液，４５℃减压浓缩至过滤液原体积的３０％，浓缩液３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液，加入３倍体积的９５％乙醇沉淀粗多糖。
多糖沉淀加水复溶，透析、Ｓｅｖａｇ法去蛋白，反复多次，至２８０ｎｍ紫外检测无明显吸收峰。
再以３倍体积９５％乙醇沉淀多糖，最后经无水乙醇脱水，丙酮、乙醚洗涤，得银杏白果粗多糖，得率０．８７％。
１．３银杏外种皮多糖（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ ｅｘｏｃａｒｐｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＧＢＥＰ）的提取［１０］１００ｇ银杏外种皮置１０００ｍｌ三角烧瓶中，沸水提取１ｈ，过滤后重复水提三次，合并滤液，于水浴上蒸发浓缩，加入适量无水乙醇，摇匀静置１２ｈ，低温超速离心，将所得的沉淀物分别用丙酮和无水乙醇洗涤，减压抽滤、真空干燥得灰白色粗多糖粉末，得率６．５８％±１．３９％。
由上可见，银杏多糖以外种皮中含量最高，其次是银杏叶，白果中多糖含量较低。
２银杏多糖的分离纯化黄桂宽等［４］将水提醇沉后的粗多糖（ＧＢＬＰ）上ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００ （３ｃｍ×４５ｃｍ）层析柱，用０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ洗脱，分离得到两种纯银杏叶多糖ＧＢＬＰ－１和ＧＢＬＰ－２，经电泳和凝胶柱色谱鉴定均为单一多糖，平均分子量分别为１１×１０４和２×１０４。
Ｊｏｓｅｆ Ｋｒａｕｓ［６］研究了银杏叶水溶性多糖的纯化方法。
银杏叶粗多糖上ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ （３．５ｃｍ×２０ｃｍ）色谱柱，用０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｋ－Ｐｉ缓冲液（ｐＨ ６．０）平衡，依次用水、０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｋ－Ｐｉ、０．５ｍｏｌ／Ｌ Ｋ－Ｐｉ缓冲液（ｐＨ ６．０）洗脱，分别得到ＧＦ１，ＧＦ２和ＧＦ３组分。
陈群等［７］将银杏白果粗多糖溶于水，先后加入９５％乙醇至乙醇终浓度分别为３０％，５０％和８０％，分别在４℃条件下静置４ｈ，８０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，收集沉淀。
乙醇终浓度为３０％时无沉淀，５０％时沉淀较多，８０％时有少量沉淀，沉淀均为白色粉末。
将５０％乙醇分离所得的沉淀以无水乙醇、丙酮、乙醚相继洗涤，室温干燥后溶解在０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ缓冲液中（浓度３ｍｇ／ｍｌ），用相同缓冲液透析２４ｈ，过滤除去不溶物，过Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２００ （２．６ｃｍ×３０ｃｍ），上样量３ｍｌ，０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ洗脱，洗脱速度１８ｍｌ／ｈ，分部收集，苯酚－硫酸法检测。
经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２００层析纯化得一主峰。
将主峰收集液以去离子水透析４８ｈ，冷冻干燥，得纯化银杏白果多糖。
３银杏多糖的分析３．１定性鉴别［２］［９，１０］银杏多糖常用碘－碘化钾反应、Ｍｏｌｉｓｈ反应、茚三酮反应进行定性鉴别。
若碘－碘化钾反应呈阴性，说明样品中不含淀粉；Ｍｏｌｉｓｈ反应呈阳性，说明样品中含糖；茚三酮反应呈阴性，说明样品中不含氨基酸或蛋白质。
３．２纯度检测［３］［１１］多糖纯度可用聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋酸纤维薄膜电泳和凝胶色谱法检测。
聚丙烯酰胺凝胶电泳所用缓冲液为ｐＨ９．５的硼砂液，染色剂是高碘酸－希夫试剂；醋酸纤维薄膜电泳所用缓冲液为ｐＨ１２．０的硼砂液，甲苯胺蓝染色。
凝胶色谱法所用凝胶为Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０和ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０，０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ洗脱，蒽酮－硫酸法或苯酚－硫酸法检测。
多糖经两种电泳均为单一色带，经凝胶色谱柱层析，流出液均为单峰，可说明它们均为单一组分。
３．３含量测定多糖含量一般采用苯酚－硫酸法［１１，１２］或蒽酮－硫酸法测定［１３］。
３．４分子量测定［３～５］［７］Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０或Ｇ－２００层析柱，用４种已知分子量的Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ－１０，Ｔ－４０，Ｔ－７０，Ｔ－１００为标准多糖分别上柱，０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ洗脱，蒽酮－硫酸法测定多糖含量，分别求得洗脱体积Ｖｅ；用分子量大于２×１０６的蓝色葡聚糖上柱求外水体积Ｖｏ，将Ｖｅ／Ｖｏ与分子量对数关系作图得标准曲线。
样品同法上柱求Ｖｅ，根据标准曲线得平均分子量。
３．５结构分析黄桂宽等［３］从银杏叶水提液中，得到两种多糖，经凝胶过滤、高效液相色谱分析、过碘酸钠氧化、Ｓｍｉｔｈ降解、红外光谱等方法，证实一种银杏叶分子量为１．７×１０５，含葡萄糖，鼠李糖、木糖，其摩尔比为４９．８２：２８．４０：２１．７５，糖基以β－（１→６） （１→３）（１→４）连接；另一种多糖是葡聚糖，分子量为１．４×１０４，糖基以α－（１→４）（１→３）（１→６）连接。
靳菊情等［５］将酸水解后的银杏叶多糖用气相色谱分析，结果表明多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖组成，为α－苷键连接的杂多糖，平均分子量为１．０４×１０６ 。
Ｊｏｓｅｆ Ｋｒａｕｓ［６］等从银杏叶中分离得到水溶性中性多糖ＧＦ１、水溶性酸性多糖ＧＦ２和ＧＦ３组分。
ＧＦ１由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成；ＧＦ２除了组成ＧＦ１的４种单糖外，还有鼠李糖；ＧＦ３由阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖组成。
陈群等［７］等将水解后的白果多糖用高效毛细管电泳分析，结果显示白果多糖是由Ｄ－甘露糖组成的匀多糖，分子量１．８６×１０５。
宋根平等［１０］用纸层析法分析了外种皮多糖水解物的成分，结果表明外种皮多糖由葡萄糖、果糖、半乳糖及鼠李糖组成，ＩＲ光谱显示多糖的特征峰，表明含酰胺键和含呋喃糖构型，且为α－苷键，推断该多糖为α－苷键肽多糖。
４银杏多糖的活性研究最初多糖以它对免疫系统有重要调节作用而引起人们的注意［１４］。
２０世纪６０年代开始，科学家们渐渐发现多糖还具有抗肿瘤、抗衰老、抗感染、降血糖血脂、治疗爱滋病等方面活性。
近年来，又发现多糖的糖链在控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长和衰老等方面起着决定性的作用。
银杏多糖是银杏中一重要的活性成分，近年来研究发现它具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老等多种活性作用。
４．１免疫调节作用许爱华等［１５］报道：体外实验，银杏外种皮多糖可促进ＣｏｎＡ诱导的荷瘤小鼠脾脏Ｔ淋巴细胞增殖和ＬＰＳ诱导的荷瘤小鼠脾脏Ｂ淋巴细胞增殖；体内实验，可促进荷瘤小鼠Ｔ淋巴细胞增殖和Ｂ淋巴细胞增殖，还可增强荷瘤小鼠ＮＫＣ活性及ＩＬ－２活性，提示外种皮多糖对荷瘤小鼠细胞免疫和体液免疫功能低下状态有显著调节作用。
