醋酸纤维素薄膜作用电泳的支持物有何优缺点？ [标签：基础知识]
提问者：游客浏览次数：246 提问时间：2008-09-07 01:38
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醋酸纤维素薄膜电泳的特点：
醋酸纤维素薄膜是由醋酸纤维素加工制成的。
醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体。
它有以下优点：
①电泳后区带界限清晰；
②通电时间较短（二十分钟至一小时）；
③它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；
④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。
它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。
醋酸纤维素薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。
根据样品理化性质，从提高电泳速度和分辨力出发选择缓冲液的种类，pH和离子强度。
选择好的缓冲液最好是挥发性强，对显色或紫外光等观察区带没有影响，若样品含盐量较高时，宜采用含盐缓冲液。
例如血清蛋白电泳可选用pH8.6的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液；氨基酸的分离则可选用pH7.2的磷酸盐缓冲液等。
电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条。
在欲点样的位置用铅笔做上记号，点上样品，在一定的电压，电流下电泳一定时间，取下滤膜，进行染色。
不同物质需采用不同的显色方法，如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位，但许多物质必须经染色剂显色。
醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下，溶于一定的溶剂中进行光密度测定。
也可以浸于折射率为1.474的油中或其他透明液中使之透明，然后直接用光密度计测定。
它的缺点是厚度小，样品用量很小，不适于制备。
原理：
醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate membrance electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物。
它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。
它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以
0.1mm-0.15mm为宜。
太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。
醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较，有以下优点
（1）醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少，无"拖尾"现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。
（2）快速省时。
由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45-60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min 左右。
（3）灵敏度高，样品用量少。
血清蛋白仅需2μl血清，甚至加样体积少至0.1μl，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带。
临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。
（4）应用面广。
某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。
（5）醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。
2、醋酸纤维素薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，操作简单，但分离效果不太好。
如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只能分离出5-6条区带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带。
[应用意义]
由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、廉价。
目前已广泛用于检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病，肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而成为医学和临床检验的常规技术。
[注意事项]
1、醋酸纤维素薄膜的预处理
市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。
将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮15s-30s时，膜片吸水不均匀，则有白斑点或条纹，这提示膜片厚薄不匀，应舍去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。
由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小，浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构。
最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。
点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。
但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。
吸水量以不干不湿为宜。
为防止指纹感染，取膜时，应戴指套或用镊子。
2、缓冲液的选择
醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液，其浓度为
0.05mol/L-0.09mol/L。
选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。
选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间的膜长度为8 cm-10cm，则需电压25V/cm 膜长，电流强度为0.4mA/cm-0.5mA/cm膜宽。
当电泳达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。
缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中不易分辨。
3、加样量
加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。
作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量则越少，对分离更有利。
如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。
如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品0.1μl-0.5μl约相当于5μg-1000μg 蛋白。
血清蛋白常规电泳分离时，每厘米加样线加样量不超过1μl，相当于
60μg-80μg的蛋白质。
但糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。
对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。
点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。
4、电量的选择
电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4mA/cm-0.5mA/cm宽膜为宜。
电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。
电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。
5、染色液的选择
对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择。
其原则是染料对被分离样品有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免引起醋酸纤维素膜溶解。
应控制染色时间。
时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅不宜区分，或造成条带染色不均，必要时可进行复染。
6、透明及保存
透明液应临用前配制，以免冰乙酸及乙醇挥发影响透明效果。
这些试剂最好选用分析纯。
透明前，薄膜应完全干燥。
透明时间应掌握好，如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。
透明后的薄膜完全干燥后才浸入石蜡中，使薄膜软化。
如有水，则液体石蜡不易浸入，薄膜不易平展。
