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酶联免疫反应加速仪在检测HBsAg中的应用

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酶联免疫反应加速仪在检测HBsAg中的应用临床研究

刘军礼1󰀁马艳侠2(1咸阳市疾病预防控制中心󰀁陕西󰀁咸阳󰀁712000;

2陕西中医学院附属医院󰀁陕西󰀁咸阳󰀁712000)

󰀁󰀁󰀂摘要 󰀁目的󰀁探讨酶联免疫反应加速仪在酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙型肝炎乙肝病毒表面抗原(HBsAg)中的应用。方法󰀁用酶联免疫反应加速仪和常规温育方法同步检测5个浓度的HBsAg定值血清,同时用实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA,并对结果进行比较分析。结果󰀁5个浓度的HBsAg定值血清用两种方法检测的HBsAg吸光度值(OD值)比较,有显著性差异(P<0.05)。有4个浓度的HBsAg定值血清定性结果相一致,0.5IU/ml的HBsAg定值血清用常规温育法检测结果为阴性,用酶联免疫反应加速仪检测结果为阳性,而0.5IU/ml的HBsAg定值血清HBV-DNA的含量均大于1!103拷贝/ml。5个浓度的HBsAg定值血清,酶联免疫反应加速仪的OD值CV%分别为2.3、2.5、2.0、2.2、2.4,常规温育方法的OD值CV%分别为3.8、4.4、4.3、4.7、4.5。结论󰀁酶联免疫反应加速仪在确定最佳反应时间条件下,具有加速抗原抗体反应的作用,可以提高ELISA检测的灵敏度,利于临床判读∀灰区#标本的结果,且重复性好,可替代常规温育方法,值得推广。󰀂关键词 󰀁乙型肝炎󰀁HBsAg󰀁酶联免疫反应加速仪󰀁常规温育法󰀁∀灰区#标本

󰀁󰀁目前,国内最常使用的测定乙肝病毒表面抗原

(HBsAg)的方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)。ELISA

法简单、方便、快速,进口试剂盒可测到的血清HBsAg

最低浓度为0.5IU/m,l国产试剂盒目前能达到1IU/

ml。我们将一种酶联免疫反应加速仪应用于国产试剂

盒ELISA法检测HBsAg,和常规的温育方式比较,发现

应用此仪器可以提高ELISA检测的灵敏度,可测到的血

清HBsAg阳性的最低浓度为0.5IU/ml。酶联免疫反

应加速仪有利于临床判读∀灰区#样本结果,和实时荧光

定量聚合酶链反应(PCR)法检测HBV-DNA的检测结

果相符合。现报道如下。

1󰀁材料与方法

1.1󰀁HBSAg定值血清󰀁购自康彻思坦生物公司,含量

分别为0.2IU/ml、0.5IU/ml、1IU/ml、2IU/ml、4IU/

m,l规格为0.5ml/支,批号200905002。

1.2󰀁分组󰀁每个浓度HBsAg定值血清取4支,每支取

5次共20次,分别用酶联免疫反应加速仪、常规温育方

法测定HBsAg。

1.3󰀁试剂󰀁上海科华生物技术有限公司生产的乙肝

HBsAg检测试剂盒,批号20090709;中山大学达安基因

股份有限公司生产的HBV-DNA试剂盒,批号

2009021。1.4󰀁仪器󰀁NY/MMJ酶联免疫反应加速仪(上海复星

长征医学科学有限公司)、MK3酶标仪(芬兰雷勃)、

37∃恒温水浴箱(上海跃进医疗仪器厂)、微量振荡器

(姜堰市电子仪器厂)、40~200ul移液器(芬兰雷勃)、

DA7600全自动荧光定量PCR检测仪(中山大学达安基

因)。

1.5󰀁检测方法󰀁使用上海科华生物技术有限公司生产

的乙肝HBSAg检测试剂盒。具体操作方法按%全国临

床检验操作规程&及试剂盒使用说明书进行[1]。用酶联

免疫反应加速仪第一步孵育15min、第二步孵育10

min;使用常规温育法37∃恒温水浴箱第一步孵育30

min、第二步孵育15min。分别读取各组的吸光度值

(OD值)、吸光度与临界值(S/CO值)(各组的临界值为

0.105),判断定性结果。并将0.5IU/ml的HBsAg定值

血清用实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA的含量,

严格按照%临床基因扩增检验实验室管理暂行办法&和

DA7600全自动荧光定量PCR检测仪的标准操作规程

进行操作。

1.6󰀁统计学处理󰀁HBsAg的OD值以均数∋标准差(󰀁x∋s)表示,采用t检验,使用SPSS12.0进行统计学分析。

2󰀁结果

2.1󰀁5种浓度HBSAg定值血清的检测结果󰀁5种不同浓

3󰀁讨论

各组患者血常规指标与正常人群比较均具显著性差

异。地中海贫血患者的RBC、HB与缺铁性贫血患者比较

显著增高,具有显著性差异,而RDW低于缺铁性贫血患

者,与文献报道一致[3]。一般临床RDW大于0.162,MCV

小于80fL时,就可诊断为缺铁性贫血。缺铁性贫血与地

中海贫血在血常规上比较,IDA患者RBC和HB值比

THAL低,HB波动范围要稍微大些。正常RDW小于0.

150,THAL一般为0.15~0.18,IDA一般为0.18~0.23。当患者血常规RBC超过5.0!1012/L以上,MCV为60~75fL,RDW大于0.22时,需要进行电泳分析来辨别贫血

类型。在筛查时,对血常规RBC、HB、MCV、RDW等参数

进行综合分析,有助于筛查和鉴别贫血,筛查方便快速,

而且成本低廉,减少患者经济负担。

参考文献

[1]󰀁陈方平.血液学检验[M].北京:人民卫生出版社,2003:55-l36.[2]󰀁张南之,沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].北京:科学出版社,1998:49-59.[3]󰀁陈允贵.应用血常规中的RDW和MCV对贫血进行分类和早期诊断[J].中原医刊,2006,33(14):85.(收稿日期:2010-02-14)󰀁󰀁(1171(临床和实验医学杂志󰀁2010年8月󰀁第9卷󰀁第15期度的HBsAg定值血清各取4支,每支取5次共计20次,

使用上海科华生物技术有限公司生产的乙肝HBsAg检

测试剂盒分别采取酶联免疫反应加速仪和常规温育方

式测定HBsAg的OD值。5个浓度的HBsAg定值血清,酶联免疫反应加速仪的OD值变异系数[CV(%)]分别

为2.3、2.5、2.0、2.2、2.4,常规温育方法的OD值CV%

分别为3.8、4.4、4.3、4.7、4.5。两种方法的OD值采用

t检验比较,有显著性差异(P<0.05)。结果见表1。

表1󰀁5种浓度HbsAg定值血清的检测结果󰀁(󰀁x∋s)

浓度(IU/ml)n(次)加速仪OD值S/CO定性结果常规温育方式OD值S/CO定性结果t值P值

0.2200.088∋0.0020.8-0.052∋0.0020.5-57.1<0.050.5200.119∋0.0031.1+0.090∋0.0040.9-25.9<0.051200.198∋0.0041.9+0.140∋0.0051.4+40.6<0.052201.360∋0.03012.9+0.890∋0.0428.2+40.7<0.054201.896∋0.04518.1+1.447∋0.06112.8+20.5<0.05

注:SICO:吸光度值/临界值;-为阴性;+为阳性。

2.2󰀁0.5IU/ml的HBsAg定值血清的HBV-DNA含量

󰀁取4支0.5IU/ml的HBsAg定值血清,每支取5次共

计20次,用实时荧光定量PCR法检测20次的HBV-

DNA的含量,结果见表2。

表2󰀁20份0.5IU/ml的HBsAg定值血清的HBV-DNA含量

标本号加速仪HBSAgOD值常规温育方式HBSAgOD值HBV-DNA含量(拷贝/ml)1-10.1150.0892.1!1031-20.1180.0922.9!1031-30.1130.0951.8!1031-40.1200.0863.3!1031-50.1220.0842.8!1032-60.1180.0852.0!1032-70.1200.0921.5!1032-80.1190.0842.4!1032-90.1160.0931.6!1032-100.1200.0953.1!1033-110.1220.0892.8!1033-120.1240.0913.5!1033-130.1140.0901.8!1033-140.1190.0981.7!1033-150.1220.0903.2!1034-160.1180.0861.9!1034-170.1140.0822.6!1034-180.1220.0941.5!1034-190.1200.0902.3!1034-200.1180.0922.0!103

3󰀁讨论

人感染乙型肝炎病毒后,绝大多数外周血中会出现

HBsAg,HBsAg是乙肝病毒的外壳部分,它本身没有传

染性但有抗原性,是乙肝病毒感染的标志之一,乙肝

HBsAg血清学检测阳性是献血者和肝炎病人感染乙型

肝炎病毒重要依据。据文献报道,献血员中发现的HB󰀂

sAg携带者最低含量为0.5IU/m,l含量高者可达4000

000IU/ml以上。但也有少部分HBV感染者血清HB󰀂

sAg测定为阴性,如暴发性乙型肝炎、HBV基因发生变

异者等,感染者血清HBsAg测定为阴性也和ELISA检

测试剂盒的灵敏度有关。已有研究表明,在HBV感染人群中,血清中HBsAg呈低水平存在,在献血员和早期感染乙型肝炎的人群中筛查低浓度的HBsAg具有重要

意义[2]。

酶联免疫反应加速仪利用免疫反应中抗原、抗体结

合部分形成互补、凹腔内氨基酸侧键的位置要有利于产

生各种次级键同时有序施加的高频电磁波能促使离子

迁移和偶极子转动引起免疫分子振转的原理,从而使酶

联免疫反应时间由原来的几十分钟甚至数小时几乎减

少一半时间完成,它加快了抗原抗体的结合反应过程,

保证了温育批间测定的一致性,提高了检测灵敏度,广

泛应用于加速酶联免疫反应[3]。由本文的实验结果可

以看出,使用酶联免疫反应加速仪可比使用常规温育方

式大幅缩短乙肝HBsAg的检验时间(由以前的45min

缩短为25min),在检测低值和高值标本时,虽然两组的

定性结果无显著性差异,但检测的OD值有显著性差

异。在临界值标本(0.5IU/ml)的检测时,常规的温育

方法会出现假阴性,许多处于∀灰区#的标本其实已经存

在HBV-DNA的复制而具有传染性[4]。所以在免疫学

检验中的S/CO数值以1为临界点,上下浮动10%为∀灰区#。小于∀灰区#即可判定为阴性反应,大于灰区

即可判定阳性反应。处于∀灰区#的标本需要重新检测,

暂不能判定。而应用酶联免疫反应加速仪提高了

ELISA检测的灵敏度,避免了处于∀灰区#的HBsAg检

测结果和荧光定量PCR检测的HBV-DNA结果不一致

的现象。因此酶联免疫反应加速仪有利于临床∀灰区#

标本的正确判读结果,对临床正确、快速诊断有很大的

积极的意义,

参考文献

[1]󰀁叶应妩,王毓三,主编.全国临床检验操作规程[M].3版.南京:东南大学出版社,2006:618-619.[2]󰀁陈瑜,钟步云,徐根云,等.低水平血清乙肝病毒表面抗原测定及其临床意义[J].中华检验医学杂志,2001,24(1):39-41.[3]󰀁瞿良,李云,滕仪,等.NY/MMJ型酶联免疫反应加速仪在高原地区的临床使用[J].现代检验医学杂志,2007,(3):52-53.[4]󰀁徐树良,石斌,谈唯,等.荧光定量对"灰区"标本的再分析[J].中国输血杂志,2003,16(1):24-25.(收稿日期:2010-02-17)󰀁󰀁(1172(JournalofClinicalandExperimentalMedicineVol.9,No.15󰀁Aug.2010

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酶联免疫法检测HBsAg和荧光定量PCR检测HBV-DNA的

酶联免疫法检测HBsAg和荧光定量PCR检测HBV-DNA的

酶联免疫法检测ＨＢｓＡｇ和荧光定量ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ的对比研究

目的 对酶联免疫法检测HBsAg和荧光定量PCR检测HBV-DNA结果行对比研究，探讨其临床意义。方法 对45例HBsAg阴性的慢性乙型肝炎HBV感染患者采用ELISA检测HBVM（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc），同时采用PCR对其血清HBV-DNA进行定量分析；对照组为同期慢性乙型肝炎患者。结果 45例HBsAg阴性慢性乙型肝炎患者中，HBV-DNA阳性率为24.44％。结论 ELISA法检测HBV是不全面的，但PCR只能检出复制状态的病毒，难以表达非复制状态的感染，因而用PCR方法检测HBV-DNA也不能完全代替血清标志物的检测。建议必要时两者结合加强对患者的检测，以避免临床不必要的漏检。

[Abstract] ObjectiveTo compare the clinical value and reliability of ELISA（enzyme linked immunosorbent assay） and PCR（polymerase chain reaction）in

examining HBsAg（hepatitis B surface antigen） and HBV-DNA（hepatitis B virus-

DNA）. MethodsExamining HBVM（HBsAg，Anti-HBs，HBeAg，Anti-HBe，Anti-HBc）by ELISA and HBV-DNA by PCR of 45 HBV patients. ResultsOf all the

45 HBV patients，the positive rate of HBV-DNA was 24.44%. ConclusionELISA and

PCR can not correctly examine the results and in clinical we should examine blood by

人乙肝表面抗原（HBsAg）酶联免疫分析试剂盒使用说明书

人乙肝表面抗原（HBsAg）酶联免疫分析试剂盒使用说明书

人乙肝表面抗原（HBsAg）酶联免疫分析试剂盒使用说明书

人乙肝表面抗原（HBsAg）酶联免疫分析

试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用。

检测范围：96T

5IU/L-150IU/L

使用目的：

本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中乙肝表面抗原（HBsAg）含量。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人乙肝表面抗原（HBsAg）水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入乙肝表面抗原（HBsAg），再与HRP标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的乙肝表面抗原（HBsAg）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人乙肝表面抗原（HBsAg）浓度。

试剂盒组成

130倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7终止液6ml×1瓶

2酶标试剂6ml×1瓶8标准品（240IU/L）0.5ml×1瓶

3酶标包被板12孔×8条9标准品稀释液 1.5ml×1瓶

4样品稀释液6ml×1瓶10说明书1份

5显色剂A液6ml×1瓶11封板膜2张

6显色剂B液6ml×1/瓶12密封袋1个

标本要求

1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀

释。

120IU/L5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液

60IU/L4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液

30IU/L3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液

15IU/L2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液

乙肝酶联免疫法检测的原理

乙肝酶联免疫法检测的原理

乙肝酶联免疫法检测的原理

乙肝酶联免疫法是一种常用的乙肝病毒感染诊断方法，其原理是基于抗原抗体反应来检测乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和抗体（抗-HBs）的存在。它通过将HBsAg或抗-HBs抗体与酶标记的二抗结合，然后通过酶标底物反应产生可测量的信号，从而确定乙肝病毒感染的存在。

乙肝酶联免疫法的操作步骤主要包括试剂配置、标本处理、免疫反应、洗涤和检测。以下详细介绍这些步骤及其原理：

1. 试剂配置：首先，需要配置好抗原和抗体的试剂。乙肝酶联免疫法常用的抗原有HBsAg和抗-HBs抗体，抗体则常用具有酶标记的二抗。此外，还需配置其他试剂，如缓冲液、阻断剂和洗涤液等。

2. 标本处理：将需要检测的血清标本或其他生物体液（如尿液）进行处理，除去非特异性的干扰物质，并将其置于试剂板或其他检测材料上。

3. 免疫反应：在样本中加入抗-HBs酶标记复合物，复合物中的二抗可以与抗体结合，形成抗原-抗体-酶标记试剂的复合物。然后，加入HBsAg或抗-HBs抗体，使之与复合物中的抗体结合，形成特异性抗原-抗体复合物。

4. 洗涤：洗去没有结合的非特异性抗体或其他干扰物，以减少误差。这一步骤基于特异性抗原-抗体结合力强于非特异性结合的原理。

5. 检测：加入酶标底物，在适当的条件下进行反应。酶标底物随后会被酶催化，产生显色或荧光等检测信号。信号的强度可以反映出目标物的浓度，进而判断样本中是否存在乙肝病毒感染。

乙肝酶联免疫法的原理基于免疫学的基本原理。乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和抗体（抗-HBs）在乙肝感染过程中分别作为病毒的外壳蛋白和宿主免疫系统的产物，它们之间可以发生抗原抗体反应。通过将HBsAg或抗-HBs抗体与酶标记的二抗结合，允许使用酶标底物作为信号产生体，从而可以定量或半定量地检测HBsAg或抗-HBs的存在。

乙肝酶联免疫法具有许多优点，如操作简便、结果快速、灵敏度高和特异性强等。然而，也存在一些局限性，如易受到样本中其他抗体的干扰、需要定期校准和质控等。

乙肝表面抗原 酶联免疫法 临界值

乙肝表面抗原 酶联免疫法 临界值

乙肝表面抗原 酶联免疫法 临界值

乙肝表面抗原（HBsAg）是乙型肝炎病毒的外壳蛋白，它是乙型肝炎病毒感染的主要标志。酶联免疫法（ELISA）是一种常用的实验室技术，用于检测体液中特定蛋白质的存在。而临界值指的是在检测中用来确定阴性或阳性结果的临界数值。

在乙肝病毒感染的诊断中，酶联免疫法通常用于检测乙肝表面抗原。对于HBsAg的酶联免疫法检测结果，临界值是指用来确定检测结果是阴性还是阳性的数值。一般来说，如果检测结果低于临界值，就会被判定为阴性，而高于临界值则被判定为阳性。

需要注意的是，不同的实验室和不同的检测试剂可能会有不同的临界值。此外，临界值也可能会根据特定人群的情况而有所不同，比如儿童、成人或特定健康状况的个体。因此，在进行乙肝表面抗原的酶联免疫法检测时，应该参考具体实验室提供的参考范围，并由专业医生进行解读。

总的来说，乙肝表面抗原的酶联免疫法检测中的临界值是用来确定检测结果的阴性或阳性的数值，但具体数值会因实验室和人群情况而有所差异。因此，在进行相关检测时，应该咨询专业医生以获取准确的解读和建议。