牛分支杆菌广西分离株Hsp 65基因的克隆及序列分析

65肉牛魏氏梭菌病的临床特点及防治措施作者：商大智来源：《现代畜牧科技》 2017年第1期1 病原及流行特点肉牛魏氏梭菌病是由魏氏梭菌引起，也叫产气荚膜梭菌，菌体为两端钝圆的直杆状，大小为(0.6～2.4) ym×(1. 3～19. O)tim，呈单个或者成对存在，没有生长鞭毛，无法自行运动，经过革兰染色结果呈阳性。

菌体能够形成较大的圆形芽胞，一般存在于菌体的中央或者近端，大部分菌株能够形成荚膜。

该病主要是由于魏氏梭菌污染环境、饮水、饲料等，当肉牛食人菌体或者芽孢后，就会进入肠道，并开始大量繁殖，从而使其出现发病。

另外，当气候骤变，突然更换饲料或者改变饲养环境等，会导致机体抵抗力减弱，促使肠道菌群发生失调，导致肠道本身存在的魏氏梭菌开始大量繁殖，也容易使其出现发病。

2 临床症状最急性型。

病牛没有表现出任何前驱症状，而是在拴系或者放牧过程中突然出现异常，四肢软弱无力，行走摇晃，且无法稳定站立，往往卧地，有时也会在站立时伸直四肢用于支撑身体，即使对其进行驱赶，也不会行走，或者出现倒退以及步态不稳、缓慢走动；精神萎靡，将头触地后保持呆立不动；肌肉震颤，特别是后躯非常明显；跳跃、起卧后往往跌在地上，四肢如同游泳状不断划动，且头颈向后伸直，发出数声呜叫后快速死亡。

病程持续最短时只有几分钟，最长也只有1～2h。

还有些病牛在晚上一切正常，但在第二天早晨发现死于舍内。

病牛死后腹部快速胀大，并有混杂红色泡沫的液体从口腔流出，舌伸到口外，肛门发生外翻。

急性型。

病牛表现出体温升高或者保持正常，呼吸加速，心跳加快，精神萎靡或者烦躁不安，食欲减退或者完全废绝，四肢、耳鼻发凉，全身颤抖，行走摇晃。

病牛出现症状后病情快速恶化，并倒地不起，全身肌肉明显抽搐震颤，头颈后仰，四肢僵直，不停划动，大量流涎，口腔黏膜发绀，腹胀、腹痛明显，发出数声狂叫后出现死亡。

亚急性型。

病牛表现出间歇性不安，发作时两眼圆睁，两耳竖直，精神处于高度紧张的状态，接着变得安静，并不断呈周期性反复发作，最终发生死亡。

文章编号：1001-764X（2011）08-609-03·综述·结核分枝杆菌的分子分型技术研究进展*代旭磊1a，柳爱华1b，宝福凯1a，汪亚玲2，文霞1a，赵勤2，吕松琴2（1．昆明医学院a．微生物学与免疫学教研室，b．生物化学与分子生物学教研室，昆明650031；2．昆明市第三人民医院，昆明650032）关键词：结核分枝杆菌；分子分型；技术中图分类号：R446．5文献标志码：A结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是细胞内致病菌，流行病学资料显示，我国结核病呈高患病率、高耐药率、高死亡率、高感染率、病例发现率低等特点［1］。

结核病的诊断主要根据病史、胸片、痰培养、涂片抗酸染色等。

提供快速、敏感、特异、可靠、简便、适合临床应用的实验室检查技术是目前研究的重点之一。

MTB基因分型技术能更准确地预测疾病的暴发流行及传播模式，主要是根据其插入序列或重复序列通过扩增或酶切杂交获得指纹图进行分析。

本文就MTB的分子生物学分型方法的研究进展作一综述。

1结核分枝杆菌复合群标准分型方法限制性片段长度多态性（IS6110-RFIP）分析是应用最广泛的MTB基因分型方法。

IS6110属插入序列IS3家族，可根据其在基因组中插入序列数目和位置的差异而区分不同的菌株。

IS6110-RFLP具有较高的分辨率、较好的重复性及很强的鉴别菌株的能力，在国际上得到广泛的认同与应用，已被用作MTB基因分型的金标准。

但也具有一些局限性：如对IS6110拷贝数少（基因组DNA＜5 10μg）或无IS6110的菌株难以鉴定；程序复杂，操作费时、费力；图谱识读困难，需要软件支持；需菌量大，DNA提取失败率高；不同实验室以及不同实验者之间的数据难于比较，缺乏可信性［2］。

为此国际上逐渐建立一些以PCR为基础的DNA指纹分型方法，通过多种分型技术、多步分析的方法替代标准指纹分型，以达到快速鉴定的目的。

养殖与饲料2021年第02期新生牛犊腹泻大肠杆菌的分离和诊治赵玉印姜茹山东省龙口市七甲镇畜牧兽医站，山东龙口264722摘要犊牛腹泻是一种常发的肠炎性、消化不良疾病，90%的犊牛腹泻是由大肠杆菌致病引起。

犊牛发病通常在出生后2~3d ，而常见的致病性大肠杆菌是肠产毒性大肠杆菌（ETEC ）和肠黏附性大肠杆菌（EAEC ）等相关病毒。

为了减少犊牛群发性大肠杆菌，要对病源进行采集，通过科学方法把大肠杆菌分离鉴定，检测相关耐药性，研究出的结果为犊牛腹泻提供治疗依据。

关键词犊牛；腹泻；大肠杆菌；分离；治疗收稿日期：2020-09-15赵玉印，男，1987年生，助理兽医师。

1犊牛腹泻原因及症状犊牛腹泻原因是出生牛犊免疫力低下，感染了寄生虫引起。

另一种是由于乱用抗生素药物，导致肠道菌群失调，诱发其他细菌感染。

犊牛患病症状为排出白色或者黄色的稀薄粪便，食欲不振，严重的会完全废绝，精神萎靡；死亡率50%，眼眶下陷，尾部、后腿、肛门周围粘附粪便[1]。

对死亡犊牛尸体进行剖解发现，胃里有一些凝乳样物质并且混有乳清，胃黏膜肿胀，有的犊牛肠道已经没有食物的残渣，肠系膜淋巴结增大。

2分离受检病株方法按照现在常用的细菌分离鉴定试验方法，将样本的肛门拭子置于灭菌的营养肉汤中。

第一种在37℃恒温培养箱内培养12h ，接种于伊红美蓝琼脂培养基（EMB ），紫红色或者紫黑色并带有金属光泽菌落生出[2]。

第二种在恒温箱内培养18~24h 后，接种于麦康凯琼脂培养基（MAc ），红色菌落长出。

第三种在37℃恒温培养箱内培养16~24h ，接种于SS 营养琼脂培养基（NA ），出现红色菌落。

第四种在37℃恒温培养箱内培养16~24h ，接种于三糖铁培养基，在斜面和深层出现红色。

原理：在培养基中含有胆盐，可抑制大部分革兰氏阳性菌的生长。

培养基含有乳糖，大肠杆菌能分离乳糖，使pH 值下降，形成颜色菌落。

分离出的疑似大肠杆菌，分离单菌落，保存备用。

牛源A型多杀性巴氏杆菌溶血特性分析及灭活疫苗候选菌株筛选的开题报告一、研究背景及意义多杀性巴氏杆菌（Mannheimia haemolytica）是一种重要的病原菌，可引起牛羊、猪、家禽等动物的多种疾病。

其中，牛源A型多杀性巴氏杆菌是导致牛病情最为严重的菌株之一，其致病水平高、死亡率大，对牛养殖业造成了严重的经济损失。

溶血是多杀性巴氏杆菌感染后导致机体病变的关键带菌因素之一。

本研究旨在对牛源A型多杀性巴氏杆菌的溶血特性进行分析，筛选出有效的灭活疫苗候选菌株，为防治该病提供科学依据，促进牛养殖业的健康发展。

二、研究内容及方法1. 研究内容（1）对牛源A型多杀性巴氏杆菌的溶血特性进行分析，探究不同因素对其溶血能力的影响；（2）筛选出有效的灭活疫苗候选菌株，对其生物学特性进行评估；（3）利用动物实验验证灭活疫苗候选菌株的免疫保护效果。

2. 研究方法（1）菌种培养及分离：采集病牛的血、鼻腔分泌物、呼吸道分泌物等样品，分离得到牛源A型多杀性巴氏杆菌；（2）溶血能力检测：采用血红蛋白试验法、酚红试验法等方法，测定菌株溶血能力；（3）灭活疫苗候选菌株筛选：利用离子交换层析等技术，筛选出溶血原和内毒素含量低、免疫原性高、稳定性好的菌株；（4）动物实验：将灭活疫苗候选菌株接种进口腔黏膜等途径进行疫苗免疫试验，评估其保护效果。

三、研究预期结果（1）明确牛源A型多杀性巴氏杆菌的溶血特性及影响因素，为其防治提供理论依据；（2）筛选出有效的灭活疫苗候选菌株，为研究开发多杀性巴氏杆菌的疫苗提供基础；（3）通过动物实验验证免疫保护效果，为牛养殖业提供科学可靠的防疫措施。

四、研究进度安排1. 前期准备（1-2个月）（1）资料收集、文献阅读；（2）实验室搭建及设备器材购置；（3）病样采集及菌种分离培养。

2. 实验设计及开展（3-12个月）（1）菌株鉴定及毒力检测；（2）溶血特性分析及机制探究；（3）灭活疫苗候选菌株筛选及特性评估；（4）动物实验及结果分析。

·1559·黄喉拟水龟Cathelicidin 基因克隆及表达分析魏华1，谭雯予1，吴志刚1，杨祖鹏1，张洪耀1，韩书煜2，施金谷2，黄德生3，梁静真1*，黄钧1*（1广西大学动物科学技术学院/广西水生动物病害诊断实验室/广西高校水生生物健康养殖与营养调控重点实验室，广西南宁530004；2广西水产技术推广站，广西南宁530022；3合浦县水产技术推广站，广西北海536199）摘要：【目的】克隆黄喉拟水龟（Mauremys mutica ）Cathelicidin 基因（MmCath ）并分析其组织表达特征，为深入研究MmCath 基因在黄喉拟水龟先天免疫中的潜在作用提供理论依据。

【方法】运用RACE 克隆黄喉拟水龟MmCath 基因cDNA 序列，利用生物信息学软件进行序列特征分析，并通过实时荧光定量PCR 检测MmCath 基因在黄喉拟水龟不同组织中的表达特征及细菌攻毒后的表达情况。

【结果】MmCath 基因cDNA 序列全长777bp ，包括63bp 的5'非编码区、483bp 的开放阅读框（ORF ）和231bp 的3'非编码区。

MmCath 基因编码160个氨基酸残基，包括N 端的信号肽区，含有4个保守半胱氨酸（Cys ）残基的Cathelin 肽区和C 端的成熟肽区，符合Cathelicidins 蛋白家族典型特征。

MmCath 前体蛋白相对分子质量为17.74kD ，理论等电点（pI ）为5.27，其二级结构中α-螺旋占31.25%，无规则卷曲占20.63%，β-折叠占48.12%。

黄喉拟水龟MmCath 前体蛋白氨基酸序列与西部锦龟（Chrysemys picta bellii ）Cathelicidin 氨基酸序列的相似性最高，达80.63%，亲缘关系最近。

MmCath 基因在黄喉拟水龟的表达具有组织差异性，以脾脏和肝脏中的相对表达量较高，在表皮、心脏、肾脏、肺脏、脑、肠道和肌肉等组织中的相对表达量较低；嗜水气单胞菌（Aeromonas hy-drophila ）攻毒后MmCath 基因表达上调，在攻毒后第3和第6h 其相对表达量极显著高于攻毒前（0h ）的相对表达量（P <0.01，下同），之后有所下降，在攻毒后第36h 再极显著上升，随后下降。

大额牛溶菌酶(LYZ)基因序列测定和进化分析李锐;陈仁金;杨章平;陈莹;常玲玲;常洪【期刊名称】《中国牛业科学》【年(卷),期】2009(35)6【摘要】[目的]为了对大额牛与其他物种间分子系统进化研究以及为大额牛群体遗传资源评价、保护与开发利用提供理论依据.[方法]本研究依据普通牛溶菌酶(lysozyme, LYZ)基因已知序列设计引物,用PCR的方法扩增并测定了大额牛LYZ基因的编码区核苷酸序列(444 bp),并与GenBank 上8个物种相应基因编码区核苷酸序列进行比对分析.[结果]大额牛与普通牛、人、猪、家鼠、沟鼠、猊猴、鸡、斑马鱼各物种在LYZ基因编码区核苷酸序列上同源性大小分别为99.3%、76.6%、79.4%、81.8%、71.3%、68.2%、58.9%、50.5%,并分别采用邻接法(NJ)和最大简约法(MP)构建了大额牛与其他物种间分子进化树,并得到了基本一致的拓扑结构.系统发育分析发现大额牛与普通牛首先聚为一类,再与其他物种聚为一类.该系统聚类结果与动物学分类一致,表明LYZ基因适合于构建不同物种间系统进化树.[结论]本研究为进一步探索大额牛与近缘物种间分子进化,阐明大额牛的真正起源奠定一定实验基础.【总页数】6页(P1-6)【作者】李锐;陈仁金;杨章平;陈莹;常玲玲;常洪【作者单位】扬州大学动物科学与技术学院,江苏,扬州,225009;扬州大学动物科学与技术学院,江苏,扬州,225009;扬州大学动物科学与技术学院,江苏,扬州,225009;扬州大学动物科学与技术学院,江苏,扬州,225009;扬州大学动物科学与技术学院,江苏,扬州,225009;扬州大学动物科学与技术学院,江苏,扬州,225009【正文语种】中文【中图分类】S823.2【相关文献】1.大额牛Myf-5基因克隆、序列分析及其分子系统进化研究 [J], 陈玉红;钟金城;马志杰;胡汉傈;金双;罗虹2.大额牛和牦牛胃型LYZ c基因多态性及其对消化功能的适应性分析 [J], 范新阳;张自芳;邱立华;钱林东;刘丽仙;张永云;苗永旺3.奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒构建与鉴定 [J], ZHANG Zhipeng;JIANG Jingyi;XIA Hailei;JI Dejun;LI Mingxun;YANG Zhangping4.大额牛HSL基因外显子Ⅰ部分片段的序列测定及分析 [J], 常怀普;钟金城;陈智华;胡汉傈;马志杰;李子良;杨蓉生;陈玉红;张亚美5.牛亚科6个群体LYZ基因序列分析及系统进化研究 [J], 陈仁金;杨章平;毛永江;冀德君;常洪;陈莹;施雪奎;吴海涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

泌尿道解葡萄糖苷棒状杆菌的分离、鉴定和药敏分析目的：对临床分离的解葡萄糖苷棒状杆菌进行鉴定和药敏分析，为临床用药提供参考。

方法：将从我院泌尿系统结石致尿路感染患者中段尿标本中分离得到的2株菌株接种至哥伦比亚血平板和麦康凯平板上，观察其生长情况并计数；采用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）检测菌株的蛋白质谱图；提取菌株DNA，采用聚合酶链反应扩增其16S核糖体RNA（rRNA）序列，对片段大小约为1 500 bp的目标条带进行双向测序，并与GenBank数据库进行Blast 比对，鉴定菌种；采用Etest法监测2株菌株的耐药情况。

结果：2株菌株在哥伦比亚血平板上生长（菌落数>105 CFU/mL），在麦康凯平板上不生长；均为革兰氏阳性棒状杆菌，多呈栅栏样或八字形排列。

MALDI-TOF-MS鉴定其均为解葡萄糖苷棒状杆菌，可信度为99.9%，在m/z 2 431、3 089、3 364、3 378、4 200、5 508、6 302、6 637、6 730、6 946、12 603处出现特征峰；Blast比对结果显示，2株菌株与GenBank中已知解葡萄糖苷棒状杆菌的序列同源性超过98%。

药敏试验结果显示，菌株1对头孢曲松、环丙沙星耐药，对青霉素G等其他14种抗菌药物敏感；菌株2对头孢曲松、红霉素、环丙沙星、四环素、克林霉素耐药，对头孢噻肟中介，对其他10种抗菌药物敏感。

结论：2株菌株均为解葡萄糖苷棒状杆菌，对常用抗菌药物的耐药性有所差异。

该菌为罕见的泌尿道病原菌，且呈多重耐药，临床应根据菌株鉴定及药敏试验结果合理选用抗菌药物。

ABSTRACT OBJECTIVE：To identify and analyze drug sensitivity of Corynebacterium glucuronolyticum iscolated from clinic，and to provide reference for clinical drug use. METHODS：Two strains isolated from the urine specimens of urolithiasis-induced urinary tract infection patients in our hospital were inoculated into Columbia blood plate and the MacConkey plate. The growth of strains was observed and counted. Protein mass spectrometry of strains was detected by MALDI-TOF-MS. DNA of strains was extracted，and PCR was used to amplify the 16S ribosome RNA （rRNA）sequence. Bi-directional sequencing of 1 500 bp target bands was conducted. Blast comparison between it and GenBank database was conducted to identify bacterial strain. Drug resistance of 2 strains was monitored by Etest assay. RESULTS：Two strains grew on the Columbia blood plate （with colony forming unit >105 CFU/mL）and did not grow on the MacConkey plate. Two strains were Gram-positive Corynebacterium and showed palisading or eight type arrangement. Two strains were C. glucuronolyticum by MALDI-TOF-MS identification，with reliability of 99.9%. The characteristic peaks of m/z 2 431，3 089，3 364，3 378，4 200，5 508，6 302，6 637，6 730，6 946，12 603 appeared. Blast comparison showed that the sequence homology of 2 strains compared with C. glucuronolyticum strain known in GenBank were higher than 98%. Results of drug sensitivity test showed that strain 1 was resistant to ceftriaxone and ciprofloxacin，and sensitive to 14 other antibiotics as penicillin G；strain 2 was resistant to ceftriaxone，erythromycin，ciprofloxacin，tetracycline and clindamycin，moderately sensitive to cefotaxime，and sensitive to 10 other antibiotics. CONCLUSIONS：Two strains are C. glucuronolyticum，and drugresistance of them to commonly used antibiotics is different. The strains are rare pathogen of urinary tract and show multidrug resistance. Antibiotics should be selected according to the results of strain identification and drug sensitivity test.KEYWORDS Urinary tract infection；Corynebacterium glucuronolyticum；MALDI-TOF-MS；Identification；Drug sensitivity test棒状杆菌是革兰氏阳性、需氧或兼性厌氧杆菌，常定植于人体皮肤和黏膜表面[1]。

牛巴氏杆菌病的流行病学临床症状诊断和防控牛巴氏杆菌病是一种由牛巴氏杆菌引起的传染病，主要侵犯牛羊等家畜动物，但也可能在特定情况下传染给人类。

本文将针对牛巴氏杆菌病的流行病学、临床症状、诊断和防控措施进行详细介绍。

一、流行病学牛巴氏杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，主要存在于土壤和水中，是一种常见的环境杆菌。

家畜动物是其主要宿主，尤其是牛和羊。

牛巴氏杆菌通过直接接触或进食被感染的饲料、水源等途径传播给动物，并且可以通过泌尿、乳汁等途径排泄到环境中，感染其他动物或人类。

人类主要通过接触受污染的牛羊奶或肉制品等途径感染牛巴氏杆菌病。

二、临床症状1. 急性感染期：潜伏期通常为1-3周，起病较急，最常见的临床表现为高热、头痛、畏寒、乏力等急性全身感染症状。

部分患者可能伴有腹泻、呕吐、腹痛等胃肠道症状。

2. 慢性感染期：经过急性期后，部分患者可能进入慢性感染期，表现为低热、盗汗、贫血、消瘦等慢性全身衰竭症状。

3. 局部感染表现：牛巴氏杆菌可引起各种局部感染，如淋巴结炎、皮肤病变等，严重时可能形成脓肿、溃疡等。

三、诊断对于疑似感染牛巴氏杆菌病患者，可以通过以下方法进行诊断：1. 临床表现：结合患者的临床症状和流行病学史进行初步判断。

2. 实验室检测：可以通过血培养、痰培养等实验室检测方法，孵育数天后进行培养鉴定，从而确定是否感染牛巴氏杆菌。

3. 分子生物学检测：利用PCR等分子生物学方法，检测病原体DNA，有助于快速准确地诊断牛巴氏杆菌感染。

四、防控措施1. 加强动物防疫：对牛羊等家畜动物进行定期检疫、隔离和消毒，减少动物感染的机会。

2. 食品安全控制：严格控制牛羊奶和肉制品的质量安全，确保食品卫生。

3. 个人卫生：加强个人卫生管理，避免直接接触受污染的动物产品和环境。

4. 医疗卫生防护：对于怀疑感染的患者，及早进行隔离治疗，避免交叉感染。

5. 公共卫生宣传：加强对公众的牛巴氏杆菌病的宣传教育，提高大众对该病的防范意识。