《果树生物技术实验》讲义之一
实验一CTAB法提取苹果（梨）等果树基因组DNA
1、提取步骤
取0.1～0.2 g幼叶片放入液氮预冷的研钵液氮研磨成粉末状（越细越好）。
速将其转至已加入1.5 mL DNA提取洗液（表1）（加入2% β-巯基乙醇）的2.0 mL
13,000 rpm离心10 min（高速离心，务必配平，这是保护价值~5万元离心机所献出的爱心和善心），弃上清液。
再加入1.5 mL洗液，颠倒充分混匀（必要时可用移液枪辅助混匀），常温12,000 rpm ，弃上清液。
加入800～1,000 µL 65 °C预热的DNA提取缓冲液（表2，1% β-巯基乙醇此时加入
65 °C温浴30～60 min（每隔10-15 min轻轻颠倒混匀一次）。然后常温12,000离心10 min。
小心吸取上清液于 2.0 mL离心管中，加等体积CIA[氯仿(Chloroform)/异戊醇(Isoamyl Alcohol)=24/1]颠倒充分混匀（也可涡旋震荡40-60 s）。4 °C、12,000 rpm离心12 min。小心吸取上清液（Supernatant）转移到1.5 mL离心管中，避免吸到中间层。重复抽提1次。
转移上清液至新1.5 mL离心管（约400 µL），加入两倍体积-20 °C预冷无水乙醇和体积3 M的NaAc（pH=5.2），小心颠倒混匀，置于-20 °C沉淀DNA直至絮状DNA 沉淀（DNA precipitates）出现。用枪头钩出或4 °C、12,000 rpm离心10～15 min。
的乙醇洗2-3次，干燥DNA（烘箱or DNA干燥仪50 °C、15 min或超净工作台30 min）。
溶解DNA于30-60 µL dd H2O（长期保存用TE溶解），贮存于-20 °C冰箱中（备
加入10 mg/mL RNase 1µL（→0.2mg/mL），37 °C保温1 h消化RNA。
取1-2 µL、0.7-0.8%琼脂糖凝胶检测（电泳缓冲液为1×TAE）。
注：步骤
表1 DNA提取洗液（总体积50 mL）
Table 1 Washing solution for DNA extraction (Total volume 50 mL)
母液浓度取出体积和质量
0.1 MTris-HCl（pH8.0）1M 5 mL
0.35 M D-山梨醇 3.19 g
5 mM EDTA 0.5M 500 µL
10% PEG 20000 5 g
2% β-巯基乙醇（V/V）1ml（现用现加）
表2 DNA提取缓冲液（总体积100 mL）
Table 2 DNA Extraction buffer (Total volume 100 mL)
母液浓度取出体积或质量
0.1M Tris-HCl（pH8.0）1M 10 mL
0.02M EDTA（pH8.0）0.5M 4 mL
1.4M NaCl 5M 28 mL
2% CTAB（W/V） 2 g
2% PVP（W/V） 2 g
1% β-巯基乙醇（V/V） 1 mL（现用现加）
注：1 M Tris-HCl（pH 8.0）、0.5 M EDTA（pH 8.0）和5 M NaCl的母液需121 ℃湿热灭菌20 min；现配置工作液时补足用水（蒸馏水）也需121 ℃湿热灭菌20 min
10mmol/L Tris·HCl（pH 8.0）
1mmol/L EDTA（pH 8.0）
×TAE（1000mL）（定容、pH 调至8.0）
Tris 242g
冰乙酸57.1mL
EDTA 100mL [0.5mol/L（pH8.0）]
3.参考文献Reference
陈大明，等. 1997. 一种木本果树基因组DNA提取方法研究. 浙江农业大学学报，23（6）：621-624.
乔玉山，等. 2004. 中国李基因组DNA提取方法的优化. 上海交通大学学报·农业科学版，22（2）：138-142.
第二种方法是陈大明等（1997）方法的改进，不当之处请批评指正；篇幅所限文献作者未全部列出，谅解之！
CTAB: 十六烷基三甲基溴化铵
