PCR-DNA测序技术检测结核分支杆菌耐多药基因突变的研究

国际检验医学杂志２００８年２月第２９卷第　塑！ｎｔ　！　！　：　！　：　

ＰＣＲ—ＤＮＡ测序技术检测结核分支杆菌　

耐多药基因突变的研究　

熊国亮　予季　张慧慧　刘珍琼　

【摘要】　目的　应用ＰＣＲ—ＤＮＡ测序技术快速检测同时耐利福平和异烟肼结核分支杆菌分离株　ｒｐｏＢ、ＫａｔＧ基因突变，评价其在检测结核分支杆菌耐多药性方面的价值。方法４７株耐利福平和异　烟肼结核分支杆菌临床分离株及３Ｏ株结核分支杆菌敏感分离株用ＰＣＲ—ＤＮＡ测序技术分别检测　ｒｐｏＢ、ＫａｔＧ基因突变。结果４７株耐多药结核分支杆菌分离株中，检出４３株ｒｐｏＢ基因突变，突变　检出率为９１．５　（４３／４７）；３ｌ株ＫａｔＧ基因突变，突变检出率为６６．０　（３１／４７）；ｒｐｏＢ和ＫａｔＧ基因同　时突变者３ｌ株，突变检出率为６６．０　（３１／４７）。３０株结核分支杆菌敏感株检出ｌ株ＫａｔＧ基因突变。　结论ＰＣＲ—ＤＮＡ测序技术方法敏感、准确、特异，可快速检测结核分支杆菌ｒｐｏＢ、ＫａｔＧ耐药基因突　变，有利于耐多药结核分支杆菌耐药性的快速检测。　【关键词】分支杆菌，结核；　基因，ＭＤＲ；　聚合酶链反应；　突变　中图分类号：Ｒ４４６．６１；Ｒ３７８．９１１　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７３—４１３０（２００８）０２—１０１—　０３　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｂｙ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ－ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｘ１０ＮＧＧｕｏ—ｌｉａｎｇ，ＹＵ　Ｊｉ，ＺＨＡＮＧ　Ｈｕｉ—ｈｕｉ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｃｈｅｓｔ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｎａｎｃｈａｎｇ　３３０００６，Ｃｈｉｎａ　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｈｅ　ａｉｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｉｓ　ｔｏ　ｅｍｐｌｏｙｅ　ＰＣＲ—ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｔｏ　ｒａｐｉｄｌｙ　ｄｅ—　ｔｅｃｔ　ｒｐｏＢ．ＫａｔＧ　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ。ａｎｄ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｉｔｓ　ｃｌｉｎｉｃａ１　ｖａｌｕｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　（ＭＴＢ）ｍｕｌｔｉ—ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｒｐｏＢ　ａｎｄ　ＫａｔＧ　ｇｅｎｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＰＣＲ—　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｆｏｒ　４７　ＲＦＰ—ａｎｄ　ＩＮＨ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ＭＴＢ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ａｎｄ　３Ｏ　ＲＦＰ—ａｎｄ　ＩＮＨ—ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｏｎｅｓ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｍｏｎｇ　４７　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ＭＴＢ　ｉｓｏｌａｔｅｓ。４３　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｈａｄ　ｒｐｏＢ　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　９１．５　（４３／４７）；３ｌ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｈａｄ　ＫａｔＧ　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　６６．Ｏ　（３ｌ／４７）；３ｌ　ｉｓｏｌａｔｅｓ　ｈａｄ　ｂｏｔｈ　ｒｐｏＢ　ａｎｄ　ＫａｔＧ　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　６６．Ｏ　（３ｌ／４７）．０ｆ　３Ｏ　ｄｒｕｇ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ＭＴＢ　ｉｓｏｌａｔｅｓ，ｌ　ｓｔｒａｉｎ　ｈａｄ　ＫａｔＧ　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＰＣ１　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｉｓ　ａ　ｓｅｎｅｉｔｉｖｅ，ａｃｃｕｒａｔｅ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｐｏＢ　ａｎｄ　ＫａｔＧ　ｇｅｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＭＴＢ，ａｎｄ　ｕｓｅｆｕ１　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ＭＴＢ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；　Ｇｅｎｅｓ，ＭＤＲ；Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；　Ｍｕｔａ—　ｔｉｏｎ　

利福平（ｒｉｆａｍｐｉｎ，ＲＦＰ）和异烟肼（ｉｓｏｎｉａｚｉｄ，　ＩＮＨ）是抗结核一线药物，它在结核病的治疗中起着　重要作用，结核分支杆菌同时耐ＲＦＰ、ＩＮＨ是当今结　核病化疗失败的主要因素之一，并被广泛重视口］。目　前，临床结核分支杆菌耐药性的检测以培养加药敏试　验为主，方法可靠但费时，一般需要４～６周，难以满　足临床需要。为此，结核分支杆菌耐药性快速检测成　为临床上急需解决的课题。研究已经证明，耐ＲＦＰ、　ＩＮＨ结核分支杆菌的耐药性分别与ｒｐｏＢ、ＫａｔＧ基因　突变有关　］，近年来国内外学者较多用聚合酶链反应一　单链构象多态性（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ—ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄ　Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＰＣ１　ＳＳＣＰ）方　

基金项目：江西省卫生厅立项资助项目（２００４５０６７）　作者单位：３３０００６南昌，江西省胸科医院检验科　・　ｌＯｌ・　

・论著・　

法研究结核分支杆菌ｒｐｏＢ、ＫａｔＧ基因突变与耐药性　关系，该方法重复性差，结果判断主观性强，并且不能　识别突变位点位置。ＰＣＲ—ＤＮＡ测序方法是先对培养　分离结核分支杆菌菌株中的ｒｐｏＢ基因和ＫａｔＧ基因　进行扩增，然后将扩增产物进行测序，来检测基因突　变的位点与位置，从而建立一种快速、准确、特异的检　测结核分支杆菌耐多药性的方法。　资料与方法　ｌ＿菌株：４７株同时耐ＲＦＰ和ＩＮＨ的耐多药结核　分支杆菌临床分离株；３０株对ＲＦＰ和ＩＮＨ均敏感的　结核分支杆菌临床分离株均来自本院（２００５年１月～　２００６年１０月）结核内科住院活动性肺结核患者痰标　本。标准结核分支杆菌菌株Ｈ３７Ｒｖ由中国药品生物　制品检定所提供。

　维普资讯 http://www.cqvip.com 垦　壁医学杂志２００８年２月第２９卷第２期ｈｎ　Ｊ　ＬａｂＭｅｄ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２００８，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．２　２．ＰＣＲ试剂：由中山大学达安基因股份公司提　供，ｒｐｏＢ：正义链５　一ｃＧＧ　ＡＴＧ　ＡＣＣ　ＡＣＣ　ＣＡＧ　ＧＣ－　３　，反义链５ＬＧＧＴ　ＴＴＣ　ＧＡＴ　ＣＧＧ　ＧＣＡ　ＡＡＴ一３　（２５８　ｂｐ）；ＫａｔＧ：正义链５　一ＧＣＧ　ＡＴＣ　ＡＣＡ　ＣＡＴ　ＣＣＧ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＣＡ－３　，反义链５　－ＧＴＣ　ＡＧＧ　ＧＣＧ　ＴＣＡ　ＡＧＴ　ＣＧＡ　ＣＴＧ一３　（２８０　ｂｐ）。　３．改良罗氏培养基及药敏培养基自配。　４．方法：（１）痰标本处理、改良罗氏培养、绝对浓　度药敏试验、菌型鉴定操作方法参照《结核病诊断细　菌学检验规程》［１３］。（２）结核分离株ＤＮＡ的提取：挑　取结核分支杆菌耐多药分离株和敏感株培养菌落分　别置入内含１００　Ｌ磷酸盐缓冲液的０．５　ｍＬ离心管　内，经离心半径为８　ｃｍ，１０　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，吸　弃上清液，加入１００　Ｌ浓度为４００　ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ　溶液（用含０．５　ＴｒｉｔｏｎＸ一１００液配制），混匀后置人　５５℃保温消化３　ｈ，然后改置９５℃保温灭活５　ｍｉｎ，　离心３０　Ｓ，上清液即为扩增的模板液。（３）ＰＣＲ扩增：　分别在２５　Ｌ　ｒｐｏＢ反应体系和２５　Ｌ　ＫａｔＧ反应体系　中加入上述靶ＤＮＡ模板５　Ｌ、石蜡油３０　Ｌ，经离心　半径为８　ｃｍ，１５　０００　ｒ／ｍｉｎ离心３０　ｓ。两者循环条件　均为：９４℃预变性４　ｍｉｎ，然后按９４℃变性１　ｍｉｎ，　５８℃退火１　ｍｉｎ，７２℃延伸１　ｍｉｎ，共３５个循环，最后　７２℃延伸５　ｍｉｎ。每次扩增均设阳性和阴性对照。　（４）扩增产物２　琼脂糖凝胶（内含溴化乙锭）电泳：以　１００　Ｖ电泳２０～３０　ｍｉｎ，在紫外透射仪上与ＤＮＡ分　子量标准品对照出现２５８　ｂｐ荧光带者为结核分支杆　菌ｒｐｏＢ阳性，出现２８０　ｂｐ荧光带者为结核分支杆菌　ＫａｔＧ阳性。（５）扩增产物测序：由中山大学达安基因　股份有限公司完成。测序引物浓度为１０　ｐｍｏｌ／ｔｔＬ，采　用美国ＡＢＩ公司四色荧光测序核心试剂，测序热循环　为９４℃２５　ｓ一５５℃１５　ｓ一６４℃４　ｍｉｎ，共２５个周　期，读序在ＡＢＩ３７７型测序仪上进行，同时与标准结核　分支杆菌扩增ｒｐｏＢ和ＫａｔＧ基因片段产物测序进行　比对。　结　果　１．４７株耐多药结核分支杆菌分离株和３０株结　核分支杆菌敏感株ｒｐｏＢ、ＫａｔＧ基因ＰＣＲ扩增２５８　ｂｐ、２８０　ｂｐ条带全部为阳性，敏感性为１００　。　２．扩增产物测序：４７株耐多药结核分支杆菌和　３０株结核分支杆菌敏感株的ｒｐｏＢ、ＫａｔＧ基因点突变　结果详见表１。　表１敏感及耐多药结核分支杆菌ｒｐｏＢ、ＫａｔＧ　基因突变检测结果［　（　）］　３．耐多药结核分支杆菌ｒｐｏＢ、ＫａｔＧ　２个基因联　合突变者共３１株，占６６．０　。　４．４３株ｒｐｏＢ基因突变和３２株ＫａｔＧ基因突变　的位点详见表２，３。　表２　４３株ｒｐｏＢ基因突变位点　

讨　论　结核分支杆菌同时对利福平和异烟肼耐药者称　耐多药结核分支杆菌　］。结核分支杆菌对利福平耐　药９０　～９５　是由于药物作用靶分子ＲＮＡ多聚酶Ｂ　亚单位编码基因发生突变，突变主要发生在５０７～５３３　位的２７个氨基酸（８１　ｂｐ）组成的区域内　］，结核分支　杆菌对异烟肼耐药与过氧化氢酶一过氧化物酶编码基　因ＫａｔＧ和烯酰基还原酶编码基因ｉｎｈＡ等基因突变　有关　引。　本研究应用ＰＣＲ—ＤＮＡ测序技术检测４７株耐多　药结核分支杆菌ｒｐｏＢ和ＫａｔＧ基因突变，阳性率分别　为９１．５　（４３／４７）、６６．０　（３１／４７），特异性分别为　１００．０　、９６．７　。用ｒｐｏＢ基因突变来判断患者是否　耐利福平的符合率为９１．５　，用ＫａｔＧ基因突变来判　断患者是否耐异烟肼的符合率为６６．０　，结果与国内　外报道相似Ｅ７，８￣。两者联合突变阳性率为６６．０　（３１／　４７），联合检测ｒｐｏＢ和ＫａｔＧ基因突变判断患者耐多　药的符合率为６６．０　。　结核分支杆菌耐异烟肼的分子机制较复杂，本组　结果显示仍然是以ＫａｔＧ基因突变为主（６６．０　），　ｉｎｈＡ突变是引起结核分支杆菌对异烟肼耐药的一个　因素，但不是主要因素，这是本研究未将该基因突变　列入检测对象的原因。在敏感株中检测到１例ＫａｔＧ　基因突变，可能是改良罗氏培养药敏绝对浓度法中药　物浓度较高时检测为敏感，绝对浓度法检测为敏感株　的菌株在更低药物浓度下可能表现为耐药，在这些低　浓度耐药株中出现突变也是可能的。　本资料检测的耐多药结核分支杆菌基因突变位　点频率由高至低如下：ｒｐｏＢ为５３１、５２６、（下转第１０６页）

　维普资讯 http://www.cqvip.com ・　１Ｏ６　・　国　堕学袭毒　年２月第２９卷第２期Ｉｎｔ　Ｊ　Ｌａｂｉｖｉｅｄ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２００８，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．２　型的遗传是以单倍体形式传给子代，Ｒｈ阴性血型遗　传中存在着非表达的ＲＨＤ基因，遗传方式符合孟德　尔遗传分离定律和自由组合定律。　如果Ｒｈ阴性的母亲为ＲＨＤ一／ＲＨＤ一基因型，　父亲为ＲＨＤ＋／ＲＨＤ＋基因型，则胎儿１００　为　ＲＨＤ＋／ＲＨＤ一，也就是说胎儿１００　都与母亲存在　Ｒｈ血型不合；如父亲为ＲＨＤ＋／ＲＨＤ一杂合子，则胎　儿有５Ｏ　的可能为ＲｈＤ阴性，５Ｏ　的可能为ＲｈＤ阳　性，也就是有５Ｏ　９／６的可能与母亲Ｒｈ血型不合。虽然　我国Ｒｈ阴性者比例偏低，但从理论上计算，汉族人中　母子Ｒｈ血型不合妊娠的总比例与ＡＢ０血型不合妊　娠比例差不多，大约为２７　。　本研究显示可采用检测父母Ｒｈ盒子组合情况来　预测胎儿ＲＨＤ基因型，以预防和减少新生儿溶血　病。本方法对胎儿及母亲均无受伤害的风险，所需　引物少，操作简便，结果判断直观，适合基层实验　室推广应用。另外检测家系的ＲＨＤ基因结构和Ｒｈ　盒子，也可以了解Ｒｈ阴性汉族人群中ＲＨＤ基因型　的频率，有助于Ｒｈ阴性个体的检出，对建立Ｒｈ阴　性血型血库，保证Ｒｈ阴性血型者的用血，也有非常　重要的意义。　参考文　献　［１］Ｄａｎｉｅｌｓ　ＧＬ，Ａｎｓｔｅｅ　ＤＪ，Ｃａｒｔｒｏｎ　ＪＰ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　Ｗｏｒｋｉｎｇ　Ｐａｒｔｙ　ｏｎ　Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　Ｒｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ［Ｊ］．Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ，２００１，８０（３）：１９３—１９７．　Ｅ２３　Ａｖｅｎｔ　ＮＤ，Ｒｅｉｄ　ＭＥ．Ｔｈｅ　Ｒｈ　ｂｌｏｏｄ　ｇｒｏｕｐ　ｓｙｓｔｅｍ：ａ　ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．　Ｂ１ｏｏｄ，２０００，９５（２）：３７５—３８７．　［３］李翠莹，穆士杰，郑岩．血型不规则抗体筛选在临床输血中的意　义［Ｊ］．第四军医大学学报，２００２，２３（２４）：２３２７　［４］周华友，兰炯采，王晓珠，等．人ＲＨＤ基因外显子多态性研究　［Ｊ］．第一军医大学学报，２００４，２４（５）：５１３－５１６．　［５］Ｗａｇｎｅｒ　ＦＦ，Ｆｌｅｇｅｌ　ＷＡ．ＲＨＤ　ｇｅｎｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｏｃｃｕｒｒｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｒｈｅ—　ＳＵＳ　ｂｏｘ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２０００，９５（１２）：３６６２　３６６８．　［６］Ｃｈｉｕ　ＲＷ，Ｍｕｒｐｈｙ　ＭＦ，Ｆｉｄｌｅｒ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲｈＤ　ｚｙｇｏｓｉｔｙ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ａ　ｄｏｕｂｌｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　ｍｕｔａ—　ｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ａｎｄ　ａ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ａｐｐｒｏａｃｈ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ，２００１，４７（４）：６６７　６７２．