胶体金标记工艺汇总知识讲解
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免疫金的特性
胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合,在免疫组织化学技术中,习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质(抗原或抗体)结合,这类胶体金结合物常称为免疫金复合物,或简称免疫金(immunogold)。
胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚,一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷,与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素,其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。
来源:Gold 2
免疫金的制备
1.用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点,也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。在调节胶体金的pH值时应注意,胶体金会阻塞pH计的电极,不可直接将电极插入胶体金溶液中,宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇(PEG,20000)稳定胶体金后,再调胶体金的pH 值。
2.将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中,放置室温反应2~5min。由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附,并可使胶体金聚沉,因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度,应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。
3.加入浓度为0.2%的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。
4.离心分离,去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒径而异:对5nm 金颗粒可选用40000r/min离心1h;8nm金颗粒用25000r/min离心45min;14nm金颗粒用25000r/min离心30min,40nm金颗粒用15000r/min离心30min。
5.轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮,恢复原体积后再离心。如此洗涤2~4次。以彻底除去未结合的蛋白质。
6.免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。
缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。
多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂,PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用:一为保护胶体金的稳定性,使之便于长期保存;二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是十分重要的,不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。
免疫胶体金制备
1、蛋白质的处理:由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附,并可使溶胶聚沉,故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意,蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒,否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在,因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。
2、蛋白质最适用量的选择:将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后,分别取0.1ml(含蛋白质5~40ug)加到1ml 胶体金溶液中,另设一管不加蛋白质的对照管,5分钟后加入0.1 ml 10%NaCl 溶液,混匀后静置2小时,不稳定的金溶胶将发生聚沉,能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10%即为最佳标记蛋白量。
3、标记:在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的,在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。
下述标记步骤最为常见:
①用0.1mol/L K2CO3 或0.1mol/L HCl 调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。
②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液(体积为2~3ml),搅拌2~3分钟。
③加入5ml 1%PEG20000 溶液。
④于10000~100000g 离心30~60 分钟(根据粒径大小选择不同离心条件),小心吸去上清液(切忌倾倒)。
⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2~0.5mg/ml PEG20000 的缓冲液中,离心沉淀后,再用同一缓冲液恢复,浓度以A1cm/540nm=1.5 左右为宜,以0.5mg/ml 叠氮钠防腐,置4℃保存。
⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200 柱进行凝胶层析分离纯化,以含0.1%B SA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG 包被的金溶胶洗脱液pH 为8.2,以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。
以上操作中应注意,一切溶液中不应含杂质微粒,可用高速离心或微孔滤膜预处理。
胶体金标记蛋白质的纯化
纯化的目的就是除去其中未标记的蛋白质,未充分标记的胶体金及在标记过程可能形成的各种聚合物。其纯化方法有超速离心法、色谱柱法以及以上二者相结合应用。
(一)超迷离心法
根据胶体金颗粒大小不同及蛋白质种类不同,离心的转速和时间也不同。用牛血清白蛋白稳定的胶体金标记羊抗兔IgG,可先从低速离心(20nm颗粒用250g;5nm用4800g20min),弃去聚集的金颗粒所形成的沉淀,然后将上清液5nm金标记物用60000g于4℃离心1h,20nm和40nm金标记物用14000g于4℃离心1h.小心地吸出上清,将管底沉淀再用1%牛血清白蛋白缓冲液混悬至原量,平衡过夜后,重复离心2次,最后一次洗涤离心的沉淀,再用1%牛血清白蛋白缓冲液(含0.02mol/LNaN3)稀释到l:20.40nm金颗粒在520nm检验吸光度为0.35;20nm金颗粒为0.30;5nm金颗粒为0.25,用1%牛血清白蛋白缓冲液作空白。制备的胶体金-蛋白探针可保存于4℃,如加入50%甘油可贮于0℃以下(-18℃)1年以上。
以聚乙二醇稳定的葡萄球菌A蛋白标记胶体金,按胶体金制备方法及所得颗粒大小不同,用不同离心转速分离纯化,以白磷还原法制备的5.0nm胶体金A蛋白,用125000×g离心;抗坏血酸法制备的11.3nm胶体金-A蛋白,用150000g离心45min,可见离心管底部附贴有小片紧密的沉淀,其上为较疏松的红色沉积物,再上为透明的上清液。附贴管底的沉淀无用,以后操作步骤中不要搅起来,仍保持其贴于管底。弃去上清液后,用等体积的0.0lmol/LPBS (pH7.2)溶解疏松红色沉积物,同上重复离心1次,小心移去上清液,剩余0.5ml上清液,将疏松红色沉积物溶解后,即为初步提纯的金标-A蛋白试剂。
(二)凝胶过滤法
凝胶过滤法必须以BSA为稳定剂。将前述胶体金-蛋白质复合物装入透析袋内,置硅胶中浓缩至原体积1/10左右,用蒸馏水冲洗软化透析袋后,取出浓缩液,以15000r/min离心15min (或用上述离心法纯化后的胶体金,再进一步用此方法纯化)。吸取上清液加到丙烯葡聚糖