免疫胶体金标记手册

胶体金免疫分析技术随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。

前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。

这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。

它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA 和斑点免疫层析分析DICA。

本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。

金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。

此技术最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。

此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。

近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。

胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。

与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA 需数小时才能显示的结果。

胶体金标记技术胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。

由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。

因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。

现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等领域。

用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。

1971年，Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。

近年来的研究表明，胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。

由于胶体金作为标记物具有很多优点，因此自其问世以来，在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。

近年来，它更多的被应用于免疫学和细胞学相关分子水平的检测中。

尤其随着人们物质生活的改善，有关人类健康的问题在现实生活中已显得非常突出。

从90年代至今的多篇报道都是关于动物体或人体相关抗体和病原体检测的。

制备方法在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。

金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。

胶体金的制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。

通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。

但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例，有两种方法。

1．Frens标准方法：1)取0.01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL。

2)约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色，3)继续煮沸约5分钟后结束反应。

4)冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。

5)此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。

胶体金（金标）检验法胶体金是一种常用的标记技术，有其独特的优点。

近年已在各种生物学研究中广泛使用。

免疫胶体金技术的基本原理是：氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。

由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。

胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。

免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见紫色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。

为什么霍乱可以用胶体金（金标）检验法进行快速筛查？霍乱弧菌快速检测卡是利用单克隆抗体胶体金标记技术和膜层析技术研制而成，用于定性检测样本中可能存在的霍乱弧菌的特异性抗原A及O139血清型。

首先按常规方法制备并筛选出效价高的抗O1群A 抗原和抗O139抗原的单抗细胞株。

然后采用枸缘酸钠还原法制备胶体金颗粒，选择玻璃纤维吸附最适浓度的金标抗体。

按常规方法免疫家兔，制备霍乱弧菌的多克隆抗体。

根据检测对象（疑似病人粪便）的特殊性，研制了特异的稀释液。

一方面可裂解细菌，释放抗原，提高检测敏感性，另一方面可起到防止污染的作用。

经二年多的反复试制，我公司完成的霍乱弧菌O1群（O139）快速检测试纸，其对霍乱弧菌最低敏感性10分钟内106菌/ml阳性，达到临床最低检出量的要求，符合卫生部《霍乱防治手册》要求，且对高浓度的菌液109 菌/ml无前置反应；用萃取液、正常人粪便标本及其它大肠中寄生菌进行的特异性鉴定表明，该试纸条特异性为100%金特敏? 霍乱快速检测卡的特点是什么？最低检出量：不低于105cfu/ml适合临床需要。

快速出结果：稀释直接裂解细菌，10分钟观察结果满足疾病控制要求。

便利使用：独立包装，“插”式设计，操作简捷，避免二次污染。

免疫胶体金标记手册浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班技术资料胡东维洪健徐颖浙江大学2０0１年1０月一、胶体金的制备根据不同的制备方法,可以制备出直径1-500nｍ的胶体金粒子，但做为免疫标记探针,其直径应在３－３0nm范围内。

在氯化金（HＡuＣl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。

使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。

即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。

还原剂浓度越高,核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。

粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的1/8。

以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径３~16nm的胶体金。

因此一般胶体金探针均使用该方法进行。

但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。

此时在溶液中添加0．1～0.２％的H2O2能够去除这些残基。

双标记或制备5－10 nｍ的胶体金时建议使用该方法。

利用柠檬酸为还原剂，可以制备１2～150 ｎm直径的胶体金。

但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。

因此做单标记时,建议使用该方法制备1２-16 nm直径的胶体金。

除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备５ nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。

磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。

氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存（０.5ｇ或1ｇ)，因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的可以用1.5 ｍl试管分装为1 ｍl保存(－2０℃)。

注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理（1%双氯硅烷／氯仿浸泡1小时,烘干)。

配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。

三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存,以防污染。

胶体金免疫色谱试验测定法
胶体金免疫色谱试验（Gold Immunochromatography Assay，简称GIA）是一种常用于检测生物样本中特定分子（如蛋白质、荷尔蒙、抗体等）的定性或定量分析方法。

一般的胶体金免疫色谱试验包括以下步骤：
1. 样品处理：将待检生物样品（如血液、尿液、唾液等）进行预处理，通常包括离心、稀释或某些特殊样品的处理方法。

2. 准备试纸条：将试纸条浸泡于样品中，使试纸条上的涂层带上样品中的目标分子。

3. 上样：将预处理后的样品滴入试纸条上的样品进样孔，让样品与试纸条上的特异抗体结合。

4. 试纸条扩散：待样品进入样品孔后，样品中的目标分子会与试纸条上固定的抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

复合物会随着样品的扩散而向试纸条上移动。

5. 可视化结果：在试纸条上存在着特定检测线。

当复合物通过检测线时，会发生阳性反应，即出现颜色改变。

通过检测线的出现与否，可以判断样品中是否存在目标分子。

胶体金免疫色谱试验的优点包括操作简便、快速、便携、结果可视化等，因此被广泛应用于临床诊断、食品安全、环境监测等领域。

免疫电镜胶体金标记法-1金标法是Faulk和Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫电镜。

它是利用胶体金在碱性环境中带有负电的性质，使其与抗体相吸附，从而将抗体标记。

当用金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需加外进行染色。

在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨。

因此，免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物学的各个方面，并取得了要喜的进展，解决了一些过去未能解决的问题，80年代以来似有取代免疫电镜 PAP技术的趋势。

胶体金标记抗体技术在电镜水平应用有许多优点：首先，手续不如PAP法烦琐，不需用H2O2等损伤微细结构的处理步骤，对微细结构的影响较少。

其次，金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒清晰可辨，易于与其他免疫产物相区别。

因此，金标法还可以和PAP法相结合进行双重或多重染色的超微结构定位。

另外，利用不同直径的金颗粒标记不同的抗体，是研究突触小泡内神经递质共存的有力工具。

由于抗原抗体反应部位结合金颗粒数量的多少可进行粗略的免疫细胞化学定量研究。

金标抗体还可加入培养液中，对培养细胞内抗原进行标记定位。

曾有报告用金标记法于细胞内骨架的研究获满意的效果。

由于金具有强烈的继发电子的能力，因此，不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。

金标液无毒性，对人体无损伤。

胶体金及胶体金标记物的制备见第五章第3节。

在原位分子杂交技术在电镜水平的应用中，胶体金的标记术被科技工作者认为是当前最理想的标记物。

一、电镜水平的免疫金染色法应用于电镜水平的免疫法，可分为包埋前染色和包埋后染色，由于包埋前染色对细胞膜的穿透性差，一般只用于细胞表面的抗原标记，如需穿透细胞膜，则需辅以冻融法或加入Triton X-100、皂素等活性剂，后者会加重细胞超微结构的破坏，因此，现较普遍采用包埋后染色，现分别介绍如下：1、包埋后染色（1）超薄切片厚50～70nm左右，载于200～300网孔的镍网上。