免疫胶体金标记手册样本

降钙素原(PCT)快速检测试纸批记录一、1%HAuCl4 溶液记录 1．材料表2.操作步骤（步骤操作完毕在横线上打√）2.1称取 g HAuCl 4 至烧杯中；2.2量取V= ml 的纯化水至烧杯中，搅拌至充分溶解；2.3将溶解好的HAuCl 4溶液转移到试剂瓶中，贴上标签(注明品名，配制人，生产日期和失效期)。

操作人： 日期:______________ 复核人： 日期：______________2.4本记录递交部门经理二、2%柠檬酸三钠配制记录1．材料表2.操作步骤（步骤操作完毕在横线上打√）2.1在烧杯中加入计划配制量V= ml 的纯化水 2.2称取V g 柠檬酸钠倒入烧杯中，搅拌至充分溶解 2.3贴上标签(注明品名，配制人,生产日期和失效期)操作人： 日期：________________复核人： 日期：_________________2.4本记录递交部门经理三、10% BSA 配制记录表1．材料表2.操作步骤（步骤操作完毕在横线上打√）2.1在烧杯中加入计划配制量V= ml 的纯化水 2.2称取 g BSA ,倒入烧杯中，搅拌至充分溶解2.3将溶解好的BSA溶液转移到试剂瓶中，贴上标签，注明品名，配制人，生产日期 和失效期。

操作人： 日期：______________ 复核人： 日期：_______________2.4本记录递交部门经理四、C/T线稀释液配制记录1．材料表2.操作步骤（操作完毕在横线上打√）2.1称取g NaCl倒入烧杯中，2.2称取g NaH2PO4倒入烧杯中，2.3称取g SAC倒入烧杯中，2.4称取g NaN3倒入烧杯中，2.5量取纯化水V= L至烧杯中，搅拌至充分溶解；2.6调节PH至7.4+0.1，PH=_______；2.7贴上标签(注明品名，配制人，生产日期和失效期)，放入2-8℃冰箱保存操作人：日期： ____________复核人：日期：_____________2.8本记录递交部门经理五、胶体金制备批记录1．材料表：2. 操作步骤（操作完毕打√）2.1 量取纯化水V1=ml至烧瓶中，2.2 量取1%HAuCl4体积V2= ml至烧瓶中，加热至沸腾；2.3量取2%柠檬酸钠溶液体积V3= ml 至烧瓶中，加热至沸腾，并保持沸腾5分钟，溶液颜色首先变黑，再逐渐变红，保持沸腾10分钟，自然冷却；2.4冷却至室温后用纯化水定溶2.5贴上标签(注明品名，配制人，生产日期和失效期)，放入2-8℃冰箱保存操作人：日期：________________复核人：日期：________________2.7本记录递交部门经理六、PCT金标液制备批记录2.操作步骤（操作完毕打“√”）3.1量取胶体金V = L至离心管中，3.2 确定0.1M K2CO3的用量比例m = ，按比例加入ml至离心管中，搅拌均匀，3.3 加入标记原料m= mg至离心管中，搅拌5分钟，静止25分钟；3.4 加入V= ml 的10%BSA，继续搅拌5分钟，静止20分钟；3.5离心，转速6000 rpm，时间15 分钟，收集沉淀。

胶体金（金标）检验法胶体金是一种常用的标记技术，有其独特的优点。

近年已在各种生物学研究中广泛使用。

免疫胶体金技术的基本原理是：氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。

由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。

胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。

免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见紫色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。

为什么霍乱可以用胶体金（金标）检验法进行快速筛查？霍乱弧菌快速检测卡是利用单克隆抗体胶体金标记技术和膜层析技术研制而成，用于定性检测样本中可能存在的霍乱弧菌的特异性抗原A及O139血清型。

首先按常规方法制备并筛选出效价高的抗O1群A 抗原和抗O139抗原的单抗细胞株。

然后采用枸缘酸钠还原法制备胶体金颗粒，选择玻璃纤维吸附最适浓度的金标抗体。

按常规方法免疫家兔，制备霍乱弧菌的多克隆抗体。

根据检测对象（疑似病人粪便）的特殊性，研制了特异的稀释液。

一方面可裂解细菌，释放抗原，提高检测敏感性，另一方面可起到防止污染的作用。

经二年多的反复试制，我公司完成的霍乱弧菌O1群（O139）快速检测试纸，其对霍乱弧菌最低敏感性10分钟内106菌/ml阳性，达到临床最低检出量的要求，符合卫生部《霍乱防治手册》要求，且对高浓度的菌液109 菌/ml无前置反应；用萃取液、正常人粪便标本及其它大肠中寄生菌进行的特异性鉴定表明，该试纸条特异性为100%金特敏? 霍乱快速检测卡的特点是什么？最低检出量：不低于105cfu/ml适合临床需要。

快速出结果：稀释直接裂解细菌，10分钟观察结果满足疾病控制要求。

便利使用：独立包装，“插”式设计，操作简捷，避免二次污染。

免疫胶体金标记手册浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班技术资料胡东维洪健徐颖浙江大学2０0１年1０月一、胶体金的制备根据不同的制备方法,可以制备出直径1-500nｍ的胶体金粒子，但做为免疫标记探针,其直径应在３－３0nm范围内。

在氯化金（HＡuＣl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。

使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。

即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。

还原剂浓度越高,核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。

粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的1/8。

以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径３~16nm的胶体金。

因此一般胶体金探针均使用该方法进行。

但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。

此时在溶液中添加0．1～0.２％的H2O2能够去除这些残基。

双标记或制备5－10 nｍ的胶体金时建议使用该方法。

利用柠檬酸为还原剂，可以制备１2～150 ｎm直径的胶体金。

但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。

因此做单标记时,建议使用该方法制备1２-16 nm直径的胶体金。

除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备５ nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。

磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。

氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存（０.5ｇ或1ｇ)，因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的可以用1.5 ｍl试管分装为1 ｍl保存(－2０℃)。

注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理（1%双氯硅烷／氯仿浸泡1小时,烘干)。

配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。

三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存,以防污染。

人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（胶体金法）【药品名称】通用名：人类免疫缺陷病毒抗体诊断剂盒（胶体金法） 商品名：无英文名：Human Immunodeficiency Virus antibodies Diagnostic Kit 汉语拼音：REN LEI MIAN YI QUE XIAN BING DU KANG TI ZHEN DUAN SHI JI HE【使用目的】用于检测人血清或者血浆中的HIV(1+2)抗体 【试验原理】本试剂盒应用双抗原夹心胶体金免疫层析法检测血清/血浆中的HIV(1+2)抗体。

将通过基因工程技术制备的针对不同结合位点的两组HIV 重组抗原gp41、gp36分别用于标记和包被。

用纯化的兔抗gp41、gp36抗体作为质控线。

当样本通过层析作用在试纸条上迁移时，样本中如果含有HIV-1或HIV-2抗体，则在检测线区域将生成Ag-Ab-Ag-AU 复合物从而形成一条明显的红色线条。

无论样本中是否含有HIV 抗体，在质控线区域都将生成Ab-Ag-AU 复合物，从而形成另一条明显的红色线条。

【主要组成成分】 1）50人份/盒 1. 检测试纸条50个2. 说明书 1份 2）1人份/盒试剂条，稀释液，采血针，采血管，消毒棉球，说明书各一份。

【适用仪器】不需要任何仪器。

【标本要求】血清/血浆 【试验方法】1、试剂盒如从冰箱中取出后应平衡到室温后再从铝塑袋中取出检测卡，水平放置；2、向圆形加样孔中滴加待检样本；3、样本用量为50微升；4、在30分钟内读取椭圆形观察窗内结果 【对试验结果的解释】【该试验方法的局限性】本品仅适用于HIV （1+2）抗体的体外检测。

【产品性能指标】质控线区域的红色条带必须出现否则实验不成立。

【注意事项】 1、 全部检测工作必须符合生物安全守则规定，严格防止交叉感染。

2、 操作时须戴手套，穿工作衣，严格执行消毒隔离制度。

3、 使用前请检查本产品是否在有效期内，以及铝塑袋的密封状况； 4、 样本使用量多于200微升有可能导致溢出、流速缓慢、高背景、假阳性等结果；5、 如果样本过于粘稠有可能导致质控线暗淡甚至缺失；6、试纸条如从寒冷环境（冰箱）中取出后应平衡到室温后再使用；7、请使用新鲜的检测样本； 8、无论检测结果如何必须按照HIV 阳性污染物处理检测卡。

人类免疫缺陷病毒（胶体金法）标准操作程序1.检验目的用于体外定性检测人全血、血清或血浆样本中人类免疫缺陷病毒(HIV) 1/2型艾滋病。

2.检验程序的原理和方法采用胶体金免疫技术和层析原理，定性检测人全血、血清或血浆样本中的人类免疫缺陷病毒(HIV) 1/2型抗体。

检测阳性样本时，样本中HIV抗体与胶体金标记抗原(大肠杆菌中表达)结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的重组HIV-Ag(大肠杆菌表达) 结合形成“Au-HIV(1+2) -Ag-HIV-Ab-HI(1+2) -Ag”夹心物而凝聚显色，游离的胶体金标记重组Au-HIV(1+2) -Ag则在对照线处与鼠抗HIV单克隆抗体结合而富集显色。

阴性样本则仅在对照线处显色，30分钟内观察结果即可。

3.性能特征3.1用国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品进行检定。

3.1.1阴性参考品符合率：用HV抗体阴性参考品(N1~N20)测定，要求阳性反应不得多于2份，阴性符合率(-l-)应≥18/20。

3.1.2阳性参考品符合率：HV-1型阳性参考品符合率：用HIV-1型阳性参考品(P 1~P 18) 测定，要求应全部为阳性反应， HIV-1型阳性符合率(+/+) 应为18/18；且P 18显色强度应不低于P 17； HIV-2型阳性参考品符合率：用HV-2型阳性参考品(P 19~P 20) 测定，要求应全部为阳性反应， HIV-2型阳性符合率(+/+) 应为2/2。

3.1.3最低检出限：用最低检出限参考品(S1~S3)测定，要求阳性反应不得少于1份(≥1/3)且基质血清(S1)为阴性反应。

3.1.4重复性：用重复性参考品平行检测10次，应均为阳性反应且显色度均一。

3.1.5稳定性：37℃放置20天后，其阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、重复性应符合要求。

3.2本试利盒测定类风湿因子阳性血清、乙型肝炎病毒(HBV) 、甲型肝炎病毒(A) 、梅毒螺旋体(TP)感染者血清不会引起干扰。

包埋后免疫胶体金标记技术1.试剂固定液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%多聚甲醛+0.1%戊二醛+4%蔗糖）洗涤液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%蔗糖）醛基灭活液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%蔗糖+0.1M甘氨酸）脱水剂：甲醇（ddH2O稀释成30%，50%，70%，80%，90%，95%）包埋剂：K4M (2.7g交联剂A+17.3单体B+0.1g引发剂C)标记封闭液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4(1%BSA+0.05%TritonX-100+0.05%Tween 20) 标记洗涤液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4抗体稀释液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4(1%BSA+0.05%Tween 20)染色液：醋酸铀（3-4g醋酸双氧铀+100ml50%甲醇）；柠檬酸铅pH12（1.33g硝酸铅+1.76g柠檬酸鈉+30mlddH2O）2. 主要仪器：镍网（喷有方华膜和碳膜）、镊子、Parafilm、自制小环、冰箱（4℃至-35℃）、紫外聚合箱、培养皿、透射电镜、离子溅射仪、超薄切片机、恒温箱（28℃）0.2二钾砷酸鈉缓冲液母液pH7.4：0.4M 二钾砷酸鈉（21.4g二钾砷酸鈉/250mlddH2O）0.2M盐酸（4.5ml/250mlddH2O）50ml二钾砷酸鈉(0.4M)中加入8ml左右0.2M盐酸，调节pH至pH7.2-7.4,加入ddH2O 至终体积为100ml，即为0.2二甲砷酸鈉缓冲液母液pH7.42.5%戊二醛母液pH7.4：25%戊二醛10ml +0.2M二钾砷酸鈉缓冲液50ml，加入ddH2O至终体积为100ml，pH无需再调，现配现用4%多聚甲醛pH7.4：a.16%多聚甲醛25ml+0.2M二钾砷酸鈉缓冲液50ml，加入ddH2O至终体积为100ml，pH无需再调，现配现用b. 2g多聚甲醛粉末+40ml ddH2O,70℃加热至粉末完全溶解，加入1.07g二钾砷酸鈉，用0.2M盐酸调至pH7.4，加入ddH2O至终体积为50ml，现配现用0. 1M磷酸盐缓冲液pH7.4：NaH2PO4∙H2O1.8g+23.25gNa2HPO4∙7H2O+NaCl 5.0g.加入ddH2O至终体积为1000mlK4M：2.7g交联剂A+17..3单体B至离心管中，充入氮气以使其充分混合，在加入0.1g引发剂C，继续充入氮气至其完全溶解，配置好的K4M包埋剂-20℃保存3%醋酸铀：3-4g醋酸双氧铀至100ml浓度为50%的甲醇中，静置过夜，过滤后4℃避光保存1%柠檬酸铅：1.33g硝酸铅+1.76g柠檬酸鈉至30mlddH2O中，剧烈混匀，加入8ml1MNaOH至溶液变得澄清，加入ddH2O至终体积为50ml，最终pH12左右3. 步骤及方法3.1 取材与固定对于培养与分离的细胞，随用随取，取材时越快越好，动物组织取材的最理想的方法是经过组织灌流固定后再用锋利的刀片将其切成1mm3以下大小的组织块，投入到固定液中继续固定。

免疫电镜胶体金标记法-1金标法是Faulk和Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫电镜。

它是利用胶体金在碱性环境中带有负电的性质，使其与抗体相吸附，从而将抗体标记。

当用金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需加外进行染色。

在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨。

因此，免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物学的各个方面，并取得了要喜的进展，解决了一些过去未能解决的问题，80年代以来似有取代免疫电镜 PAP技术的趋势。

胶体金标记抗体技术在电镜水平应用有许多优点：首先，手续不如PAP法烦琐，不需用H2O2等损伤微细结构的处理步骤，对微细结构的影响较少。

其次，金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒清晰可辨，易于与其他免疫产物相区别。

因此，金标法还可以和PAP法相结合进行双重或多重染色的超微结构定位。

另外，利用不同直径的金颗粒标记不同的抗体，是研究突触小泡内神经递质共存的有力工具。

由于抗原抗体反应部位结合金颗粒数量的多少可进行粗略的免疫细胞化学定量研究。

金标抗体还可加入培养液中，对培养细胞内抗原进行标记定位。

曾有报告用金标记法于细胞内骨架的研究获满意的效果。

由于金具有强烈的继发电子的能力，因此，不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。

金标液无毒性，对人体无损伤。

胶体金及胶体金标记物的制备见第五章第3节。

在原位分子杂交技术在电镜水平的应用中，胶体金的标记术被科技工作者认为是当前最理想的标记物。

一、电镜水平的免疫金染色法应用于电镜水平的免疫法，可分为包埋前染色和包埋后染色，由于包埋前染色对细胞膜的穿透性差，一般只用于细胞表面的抗原标记，如需穿透细胞膜，则需辅以冻融法或加入Triton X-100、皂素等活性剂，后者会加重细胞超微结构的破坏，因此，现较普遍采用包埋后染色，现分别介绍如下：1、包埋后染色（1）超薄切片厚50～70nm左右，载于200～300网孔的镍网上。

实验一: TEM包埋块的制备一、实验目的学习掌握常规生物样品前处理技术及样品包埋块的制备技术。

二、实验材料小鼠肝脏细胞三、实验试剂2.5％戊二醛、 PBS、 1％锇酸、 30％丙酮、 100％丙酮、 Epon812包埋液、蜡油四、实验器材离心管、玻璃棒、滴管、移液枪、刀片、镊子、牙签、烘箱、切片机五、溶液配置1、磷酸缓冲液( Phosphate Buffer Saline, PBS)0.2molL-1 PBS 配制A液: Na2HPO4 .2H2O 35.61g加DDW 至 1000mlB液: NaH2PO4 .H2O 27.6g加DDW 至 1000ml2、不同pH磷酸缓冲液的配制pH 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6A液 (ml)18.8 24.5 30.5 36.0 40.5 43.5B液 (ml)31.2 25.5 19.5 14.0 9.5 6.53、 Epon812包埋液的配制Epon812树脂 20mlDDSA 4.6mlMNA 15.3mlDMP-30 0.8ml六、 实验步骤1、 切取1mm3左右大小的组织块, 立即放入PBS( pH7.2)配制的2.5%戊二醛中固定10-15分钟。

2、 用0.1molPBS 缓冲液冲洗三次( 每次3～5分钟) 。

3、 1％锇酸固定30分钟, 然后用缓冲液冲洗三次( 每次3～5分钟) 。

4、 丙酮脱水: 30％－50％－70％－80％－90％－100％－100％, 每级3～5分钟5、 浸透与包埋: 脱水剂: 包埋剂=1: 2, 过夜6、 第二天任意时间进行包7、 标签用硫酸纸内8、 聚合: 45 ℃ 12h 60 ℃ 24h 样品标签 学号七、注意事项1、取材的时候动作要迅速, 组织离体后应将其快速放入固定液中。

而且要尽量减少损伤, 减少牵拉或挤压组织。

组织块的大小一般为1mm3。

2、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面, 应经过抽真空的方法让样品沉入溶液中。