发酵床垫料中微生物16S rDNA PCR 反应条件的建立与优化

微生物发酵工程中的生物过程优化研究摘要：微生物发酵工程一直是生物技术领域中备受瞩目的研究方向之一。

随着科学技术的不断发展，人们对微生物发酵过程进行了深入的研究，以提高产物质量、产量和可持续性。

本论文旨在探讨微生物发酵工程中的生物过程优化研究，着重介绍优化方法、相关技术和其在不同应用领域的应用。

通过生物过程优化，可以提高发酵工程的效率，降低成本，减少环境影响，并为新药物、生物燃料、食品工业等领域的发展提供支持。

关键词：微生物发酵；生物优化；研究引言微生物发酵是一种生物技术领域的重要过程，涉及微生物生长、代谢产物的生产和回收等方面。

随着对新型产物需求的增加，以及对可持续生产的重视，微生物发酵工程的研究变得更加重要。

为了实现高效的发酵生产，研究人员一直在寻求不断改进和优化微生物发酵过程的方法。

本文将介绍微生物发酵工程中的生物过程优化的关键方面，包括方法、技术和应用领域。

一、生物过程优化方法微生物发酵工程中的生物过程优化通常包括以下方法：发酵条件优化：包括温度、pH值、氧气供应等参数的调整，以提高微生物生长和代谢产物生产的效率。

这需要细致的实验设计和数据分析。

代谢工程：通过改变微生物的遗传信息，如基因工程和重组DNA技术，来增强目标产物的生产能力。

培养基优化：确定最适合特定微生物的培养基成分，以获得更高的产量和更高的产物质量。

监测和控制系统：使用高级传感器和自动化控制系统，对微生物发酵过程进行实时监测和调整。

二、生物过程优化的关键技术微生物发酵工程的生物过程优化离不开一些关键技术的支持，这些技术包括：基因组学和蛋白质组学：通过对微生物基因组和蛋白质组的研究，可以更好地了解微生物的代谢途径和生长机制，为代谢工程提供更多信息。

生物传感器：生物传感器能够实时监测微生物发酵过程中的关键参数，如氧气浓度、酸碱度等，以便进行及时的调整。

计算模拟：借助计算模拟和数值模型，可以更好地预测微生物发酵过程的表现，并进行虚拟实验以寻找最佳条件。

16S rDNA方法鉴定细菌种属一．目的1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。

二、原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。

细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。

16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。

5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。

而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。

在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。

因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。

随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。

1、16S rRNA普遍存在于原核生物中。

rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。

2、在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。

16s扩增子测序流程引言：16s扩增子测序是一种常用的微生物学研究方法，通过对16s rRNA 基因进行扩增和测序，可以获取微生物群落的组成信息。

本文将详细介绍16s扩增子测序的流程，包括样品收集、DNA提取、扩增子设计、PCR扩增、测序和数据分析等环节。

一、样品收集：在进行16s扩增子测序之前，需要准备好待测样品。

样品可以来自环境样品、动物体内、人体内等各种来源。

在收集样品时，需要注意避免污染和样品损伤，保证样品的质量和完整性。

二、DNA提取：样品收集后，需要提取样品中的总DNA。

DNA提取的方法有很多种，常用的有CTAB法、酚/氯仿法、商用DNA提取试剂盒等。

提取的DNA应具有高纯度和高浓度，以保证后续的PCR扩增和测序的质量。

三、扩增子设计：扩增子是指用于扩增16s rRNA基因的引物。

根据不同的研究目的和物种组成，可以设计不同的扩增子。

常用的扩增子包括V1-V9区域的引物。

在设计扩增子时，需要考虑引物的特异性和覆盖范围，以确保扩增到目标基因片段。

四、PCR扩增：PCR扩增是16s扩增子测序的关键步骤。

在PCR扩增中，需要将样品中的16s rRNA基因片段扩增到目标长度。

PCR反应体系包括模板DNA、引物、dNTPs、聚合酶和缓冲液等。

PCR扩增的条件包括温度、时间和循环数等，需要根据具体的扩增子设计和样品特点进行优化。

五、测序：PCR扩增后的产物需要进行测序。

测序技术有很多种，包括传统的Sanger测序和高通量测序技术。

根据实验室条件和研究目的，选择合适的测序平台和方法进行测序。

测序的结果将得到样品中16s rRNA基因片段的序列信息。

六、数据分析：测序后的数据需要进行生物信息学分析。

首先，对测序得到的序列进行质量控制和去噪处理，去除低质量和低复杂度的序列。

然后，将序列比对到参考数据库（如Greengenes、SILVA等），进行分类学注释和物种分析。

最后，可以使用多样性分析方法（如Alpha多样性和Beta多样性分析）对微生物群落进行描述和比较。

发酵过程中的微生物菌种筛选与优化研究发酵过程中的微生物菌种筛选与优化研究发酵是一种利用微生物进行生物转化的过程，广泛应用于食品、医药、化工等多个领域。

选择合适的微生物菌种并对其进行筛选与优化是实现高效发酵的关键。

本文将从菌种筛选与优化的原理、方法和应用进行探讨。

首先，菌种筛选与优化的原理是基于微生物生理特征与发酵产物的关系，通过评估菌种的生长速度、产气量、产酸量等生物学特性，确定最适合的菌种。

此外，还需要考虑菌种的耐受性、抗污染能力、代谢途径等方面的特性，以确保菌种在发酵过程中能够稳定、高效地生长。

菌种筛选与优化的方法多样，根据发酵产物的要求和实验条件的不同，可以选择不同的方法来进行研究。

其中，传统的菌落筛选法是通过培养大量微生物菌种，并鉴定其在特定环境下的生理特征，然后根据需求选择合适的菌种。

近年来，高通量筛选技术的发展使得菌种筛选与优化的速度和效率大大提高。

例如，利用基因工程技术构建菌种库，并利用自动化设备进行大规模筛选，可以快速筛选出具有特定功能的菌种。

除了筛选合适的菌种外，菌种优化也是提高发酵效果的重要手段。

菌种优化主要包括两个方面：一是对菌种的基因组进行改造以增加产物的得率和选择性；二是通过调控发酵条件来改善菌种的生长环境，增加产物产量。

菌种基因改造的方法主要包括基因突变、基因敲除和基因工程等手段。

例如，通过敲除抑制产物生成的基因，或是通过引入外源基因来增加产物的合成酶活性，从而提高产物的得率和选择性。

菌种发酵条件的优化包括温度、pH、营养物质和氧气供应等因素的调控。

通过适当的调节这些因素，可以提高菌种的生长速度和产物产量。

菌种筛选与优化研究在食品、医药、化工等众多领域中都有广泛应用。

例如，利用菌种筛选与优化技术可以获得高产酶菌种，用于食品加工中的酶法制备；通过菌种筛选与优化可以获得高效发酵产物的微生物菌种，用于合成生物柴油等领域；菌种筛选与优化也可用于医药领域的抗生素发酵以及活性代谢产物的生产。

微生物发酵过程的优化与调控微生物发酵是一种利用微生物代谢产物来生产食品、药物和化妆品等的生物工艺过程。

在微生物发酵过程中，微生物通过转化底物产生有用的化合物，并且这个过程可以通过一系列的优化和调控来提高产量和品质。

本文将讨论微生物发酵过程的优化与调控方法，以及其在不同领域中的应用情况。

首先，优化微生物发酵过程的关键是选择合适的微生物菌株和培养基。

不同的微生物菌株对底物的利用能力和产物的产量有很大的差异，因此在发酵过程中选择合适的菌株对于优化产量至关重要。

同时，培养基的成分和浓度也会影响微生物的生长和代谢，因此合理调配培养基的组成也是优化发酵过程的关键一环。

其次，控制发酵条件是提高产量和品质的重要手段。

温度、pH值、氧气供应和搅拌速度等因素都会对微生物的生长和代谢产生影响。

通过合理地控制这些条件，可以调控微生物的代谢途径，提高产物的产量和纯度。

例如，在酒精发酵中，合理控制发酵温度可以提高酵母菌的活性和产酒能力。

此外，基因工程技术在微生物发酵过程中的应用也是一个热门领域。

通过改变菌株的基因组和代谢途径，可以使微生物具备产生特定产物的能力。

例如，基因工程菌株的产生使得人胰岛素的大规模生产成为可能。

通过基因工程技术，微生物可以被赋予新的代谢路径或增强已有代谢途径，从而达到优化发酵过程、提高产物产量和改善产物质量的目的。

在食品工业中，微生物发酵广泛应用于乳制品、酱油、醋和调味品等的生产中。

优化发酵过程可以提高乳酸菌、酵母菌和酸奶菌等微生物的生长和活性，提高产品的营养价值和风味。

同时，微生物发酵还可以产生食品添加剂，如谷氨酸钠、抗生素和硝化酶等，为食品提供特殊的功能和品质。

在药物领域，微生物发酵被广泛应用于抗生素、激素和酶制剂等药物的生产。

优化发酵过程可以提高抗生素的产量和纯度，同时减少副产物的生成，从而降低生产成本。

此外，微生物发酵还可以用于生产重组蛋白药物，如重组胰岛素和重组生长激素等。

通过基因工程技术，微生物可以被改造成为高效产生重组蛋白的工厂。

土壤微生物总DNA提取及其PCR优化土壤中的微生物是土壤生态系统中非常重要的组成部分，对于土壤的生物地球化学循环和植物生长起着至关重要的作用。

因此，了解土壤中的微生物群落结构和功能对于研究土壤生态系统和提高农田肥力具有重要意义。

土壤微生物群落分析通常需要进行土壤微生物总DNA的提取，并利用PCR技术对其进行检测和分析。

本文章将介绍土壤微生物总DNA提取的步骤，并对PCR反应进行优化。

1.土壤样品采集：将土壤样品收集到干净的塑料袋中，并尽快将其带回实验室进行处理。

2.土壤样品处理：将土壤样品通过筛网过滤，去除大颗粒物质。

然后，将土壤样品进行均匀混合，以保证提取的土壤微生物样品的代表性。

可以根据具体的研究目的和需求，选择不同的土壤样品处理方法，例如：酶处理、分离培养等。

3.DNA提取：根据所选用的DNA提取试剂盒的说明书，按照其提取方案进行操作。

一般而言，土壤微生物总DNA提取的步骤包括：细胞破碎、蛋白质沉淀、DNA溶解和纯化等步骤。

4. DNA质量检测：提取的土壤微生物总DNA可以通过紫外分光光度计或凝胶电泳等方法进行检测。

常用的DNA浓度检测方法为：通过分光光度计检测DNA的吸光度260 nm/280 nm比值，一般DNA的260 nm/280 nm比值在1.7-1.9之间为纯净的DNA样品。

PCR是一种被广泛应用于土壤微生物群落分析的技术，可以检测和分析微生物群落结构和功能。

下面是PCR反应优化的几个关键步骤：1.引物设计：选择适当的引物对于PCR反应的成功至关重要，引物应能够特异性地扩增所需的目标基因片段。

引物的设计可以根据所研究的微生物基因组序列进行，也可以利用已有的引物库进行。

2.酶和缓冲液优化：PCR反应中酶的选择和相应的缓冲液对于PCR反应的效果有着重要的影响。

可尝试不同品牌和类型的聚合酶和缓冲液，根据实验结果选择最适合的组合。

3.PCR温度参数优化：PCR反应的温度参数也会对PCR反应的效果产生重要影响。

微生物发酵的优化生产微生物发酵代谢与调控主要是通过改变微生物的代谢途径和代谢流量，以实现目标产物的优化生产。

以下是一些常见的微生物发酵代谢与调控的方法：1.营养物质浓度调控：通过调整培养基中营养物质的浓度，可以影响微生物的代谢途径和代谢流量。

例如，增加氮源的浓度可以促进微生物的生长和蛋白质的合成，而减少氮源的浓度可以促进微生物的脂肪合成。

2.温度调控：温度可以影响微生物的代谢速率和细胞生长。

在一定的温度范围内，升高温度可以促进微生物的代谢速率和细胞生长，但过高的温度会导致细胞死亡。

因此，根据不同的微生物种类和目标产物，需要选择适宜的温度进行发酵。

3.pH值调控：pH值可以影响微生物的代谢途径和代谢流量。

例如，酸性条件可以促进微生物的糖酵解代谢途径，而碱性条件可以促进微生物的脂肪合成代谢途径。

因此，通过调整培养基的pH值，可以实现对微生物代谢的精细调控。

4.氧气浓度调控：对于好氧微生物，氧气是必需的，但过高的氧气浓度会抑制微生物的生长和代谢。

因此，在发酵过程中需要控制氧气的供应量，以实现微生物的最佳生长和代谢。

5.添加酶或小分子调控：通过添加酶或小分子化合物，可以实现对微生物代谢的人工调控。

例如，添加特定的酶可以促进或抑制某种代谢途径，从而改变微生物的代谢流量和产物。

6.基因调控：通过基因工程技术，可以改变微生物的基因表达，从而改变其代谢途径和产物。

例如，可以通过敲除或过表达某些基因来抑制或增强某种代谢途径，从而实现目标产物的优化生产。

总之，微生物发酵代谢与调控是一个复杂的过程，需要综合考虑多种因素。

通过精细调控微生物的代谢途径和代谢流量，可以实现目标产物的优化生产。

2.1 发酵培养基碳、氮源的选择碳源是主要的能量来源，主要在环境中为微生物在培育过程中提供能量。

目前较为常用的碳源应是己糖，主要作为微生物细胞成分和代谢的产物。

在工业规模性培育繁殖中，原料的成本及易用性是着重需要考虑的因素之一。

在发酵过程中较为常用的碳源有淀粉、蔗糖、米糠纤维等。

在微生物发酵中，碳源固然重要，但氮源同样是微生物发酵培养中必不可少的物质。

氮源主要用于微生物细胞材料和含氮的代谢产物，氮源通常分为两类，一类是延迟氮源，而另一类属于速效氮源。

延迟氮源通常包括肽和氨基酸，其主要作用机理是促进细菌生长，在代谢物的形成中同样具有促进作用[2]。

而速效氮源通常包括酵母浸膏、蛋白胨等，能够满足细菌发酵和产品合成时对氮源的需求。

在整个微生物的发酵培育过程中，通过延迟氮源与速效氮源的合理搭配，形成的负荷氮源既能满足节杆菌属细菌的生长，同时还能促进病原拮抗剂的抑制，达到良好的发酵效果。

2.2 发酵培养基中无机盐对发酵的影响磷、硫、钠、锌、锰等无机盐对微生物的生长和代谢产物的产生有一定的影响，磷是微生物生长和代谢活动的重要组成部分，参与磷脂、核酸和多种辅酶的合成，在代谢调节中发挥重要作用。

如成分失衡和高渗压升高，这将部分导致微生物的生长。

微生物发酵和发酵离子交换介质。

2.3 发酵培养基中其他成分对发酵的影响在发酵过程中，发酵培养基还需要其他能积极促进微生物发酵的成分，这大大提高了培养基对微生物发酵的影响，为其产品的形成提供了必要的营养。

其物理性质必须适应微生物发酵。

在选择原材料时，还应考虑价格，在保证质量的基础上选择低成本的原材料。

原料来源必须满足微生物发酵工程长期发展的需要。

0 引言近年来，微生物发酵工程技术得到了广泛的应用。

利用有益微生物和收集相关细菌或代谢物来提高产量和预防疾病的研究越来越多。

不同的微生物和发酵条件有利于发酵产物的生产。

国内外对发酵过程的优化主要集中在碳源、氮源、微量元素、发酵温度、pH 值、发酵时间等发酵条件上。

微生物发酵工艺改进与优化研究第一章：绪论1.1 研究背景及意义微生物发酵是一种常用的工艺，广泛应用于食品、药品、饲料和化工等产业。

通过发酵，微生物可以利用废弃物或者廉价原料合成有用的化合物，同时还能提高产率和降低成本。

然而，传统发酵工艺存在一些问题，如低产率、质量不稳定性和能源消耗等，因此，改进和优化微生物发酵工艺具有重要的意义。

1.2 国内外研究现状目前，国内外已经有许多关于微生物发酵工艺改进与优化的研究。

例如，通过选择和改造高效菌株，提高菌株的代谢能力，可以显著提高发酵产物的产率和质量。

另外，利用工程学方法，如反应工程学、遗传工程学和代谢工程学等可以优化微生物发酵过程，达到更好的产率和质量。

此外，利用物理条件、如温度、pH和气体含量等的控制，也能显著影响微生物发酵工艺。

第二章：微生物发酵工艺改进2.1 菌株筛选和改造菌株的选择和改造是改进微生物发酵工艺的重要环节。

在菌株的选择上，需要考虑其生长速度、代谢途径和特定产物的产率等因素。

通过基因工程技术，可以对菌株进行改造，例如引入外源酶的基因，增强特定产物的合成能力。

2.2 发酵条件优化微生物发酵过程中，温度、pH、氧气供给和营养物质等因素对发酵产物的产率和质量起着重要作用。

通过对这些条件的优化，可以提高微生物的生长速率、代谢活性和特定产物的含量。

第三章：微生物发酵工艺优化3.1 反应工程学优化反应工程学是将工程原理应用于微生物发酵过程中的研究领域。

通过建立动态数学模型，可以模拟微生物发酵过程的动态变化，从而优化反应过程。

通过调整反应条件、改善生物反应器的结构和控制策略，可以提高发酵产物的产率和质量。

3.2 代谢工程学优化代谢工程学是通过改变菌株的代谢路径和调控相关基因表达，从而实现产物合成的优化。

通过对代谢途径的分析和选择合适的调控策略，可以提高微生物合成特定产物的效率和产量。

第四章：微生物发酵工艺改进与优化的应用4.1 食品工业中的应用微生物发酵工艺在食品工业中得到了广泛的应用。

微生物发酵工艺的优化与调控方法微生物发酵工艺是一项应用广泛的生物工艺，被广泛应用于食品、医药、农业等领域。

然而，由于微生物的复杂性和环境的多变性，发酵工艺的优化和调控一直是一个具有挑战性的任务。

本文将探讨微生物发酵工艺的优化与调控方法，帮助我们更好地利用微生物进行生产。

首先，优化发酵培养基是提高发酵工艺效率的重要方法。

发酵培养基是提供微生物生长所需营养物的介质，其组成和配方对发酵过程具有重要影响。

首先，了解微生物的特性和代谢途径，确定其所需的营养物质种类和浓度。

其次，通过响应面试验等方法，对培养基种类和比例进行优化，以获得更好的生长环境。

此外，鉴于微生物酵母等微生物对碳源的选择性，可以在培养基中添加特定的碳源，以提高发酵效率。

其次，选择合适的微生物菌种也是发酵工艺优化的关键。

不同的微生物对环境的适应能力和代谢途径有所不同，因此选择合适的菌种对于提高发酵工艺的效率至关重要。

一方面，我们可以通过研究菌种的特性和代谢途径，选择能够适应特定环境并产生目标产物的菌株。

另一方面，利用基因工程技术，可以对菌株进行改造和优化，提高其产物生成能力和产量。

另外，控制发酵条件是优化发酵工艺的重要手段之一。

发酵条件包括温度、pH 值、溶液浓度、氧气供应等因素。

微生物对这些因素的敏感性不同，需要根据菌株的特性和产物的需求进行调控。

例如，某些菌株对温度的敏感性较高，选择适当的温度可以促进其生长和代谢产物的生成。

另外，pH值和溶液浓度的调控也可以影响微生物的生长和产物的生成。

氧气供应是微生物发酵过程中的关键因素之一，需根据微生物的需求和产物的特性进行相应的控制。

此外，使用现代生物工程技术也可以优化微生物发酵工艺。

例如，利用遗传工程技术可以改造微生物的代谢途径，提高其代谢产物的生成能力。

利用基因组学、转录组学和蛋白质组学等技术，可以深入研究微生物的基因调控网络，从而找到调控微生物发酵过程的关键基因和信号通路。

综上所述，微生物发酵工艺的优化与调控方法涉及多个方面，包括优化发酵培养基、选择适宜菌株、控制发酵条件和利用生物工程技术等。

发酵床不同深度垫料中微生物与温室气体的分布特征发酵床垫料中存在着许多能够将畜禽粪便快速降解的微生物,这些微生物是发酵床的关键因素。

本研究利用PCR-DGGE、 Real-Time PCR技术以及INNOVA1412红外声光谱监测仪,分别分析发酵床不同深度垫料中菌群相似性、大肠杆菌、乳酸杆菌、产甲烷菌的数量以及CO2、CO、N2O、NH3、CH4、H2O的浓度分布,为进一步研究发酵床垫料中群落生态及结构奠定基础。

发酵床垫料结构复杂,各个地区垫料组成不同,能否提取出纯净的DNA分子为后续分子研究的关键,本文结合前人方法,研制出能够有效去除PCR抑制因子的方法,为进一步分子生物学研究奠定基础。

研究表明,试剂盒改进方法能有效去除发酵床垫料中PCR抑制因子,且盐酸吡哆醛最适添加量为0.5M。

采用细菌通用引物968f/1401r对发酵床垫料样本的16S rDNA序列进行PCR 扩增,并利用DGGE指纹技术对扩增产物进行分析。

结果发现,发酵床不同深度垫料细菌条带数不同,中上层(0-15cm)细菌条带数目相近,波动区间为24-27条,20cm处条带数目最低,仅有13条,30cm处最多,为34条。

15cm与其他深度的菌群相似性最低,仅为51.2%,其次为表层垫料,相似度仅为57%。

表层与5cm深度处相似性最接近,达到95.6%。

通过Real-Time PCR技术对不同深度中发酵床垫料中大肠杆菌、乳酸杆菌、产甲烷菌进行定量分析。

研究发现,发酵床垫料中表层大肠杆菌数量最多,达到9.68×105cfU?g-1,随着深度递增,大肠杆菌数量减少,40cm深度处数量最少。

发酵床好氧区域能够有效控制以大肠杆菌为靶标菌的生长,欲延长发酵床分解粪便的区域,降低大肠杆菌数量,应该尽量延长发酵床功能区域,营造良好的好氧环境。

乳酸杆菌存在于发酵床不同深度的垫料中,表层数量少,仅为3.69×103cfu-g-1。

随着深度的增加,乳酸杆菌数量呈上升趋势,15cm处达到最高值6.08×103cfu?g-1。

16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。

3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。

6.BLAST比对获取相似片段。

7.构建系统进化树试剂：1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。

）。

1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高压灭菌后，室温保存。

冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。

1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。

1.410×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。

1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。

高温高压灭菌，室温保存。

1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。

1.5 10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。

室温保存。

用之前在65℃溶解。

配置时要戴口罩。

6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。

7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。

用之前在65℃溶解。

8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。

9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。

16s rDNA测序发表时间：2018-05-15 08:5216S rDNA是原核生物编码16S rRNA的基因，长度约为1500bp，由10个保守区和9个可变区（V1-V9）组成，可变区反映了物种间的差异性。

16S rDNA-seq是通过提取微生物菌群的DNA，选择可变区的特定区段(V3-V4)进行PCR扩增，再通过高通量测序的方法，帮助研究人员分析特定环境中微生物群体基因组成及功能、微生物群体的多样性与丰度，进而分析微生物与环境、微生物与宿主之间的关系，发现具有特定功能的基因。

在医学领域，主要应用于肠道微生物与疾病的关联分析，揭示疾病与健康个体间微生物的差异，研究药物或饮食干扰后菌群差异，或某一病程发展过程中肠道菌群的变化，如结直肠癌等。

技术路线•宏基因组DNA提取：根据不同的样品类型采用不同的提取方案，获得高质量的宏基因组DNA。

•DNA质量检测：Nanodrop检测DNA样品浓度及纯度；琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品完整性。

•16s可变区PCR扩增：引物设计扩增可变区的特定区段（V3-V4区）。

•第二次PCR扩增：在DNA分子两端引入接头序列及index序列。

•文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库大小分布，Qubit 3.0或荧光定量PCR 测定文库浓度。

•上机测序：根据数据量要求将文库pooling上机测序。

•数据分析：下机数据由专业生物信息分析团队进行数据分析，提供全面数据分析报告。

样品要求•样品类型：Meta样品，如粪便、土壤等或Meta DNA样品。

•样品量：Meta样品请提供2 g以上，DNA样品2 μg以上。

•样品质量：DNA无明显降解，无蛋白污染，OD260/280值≥1.5，OD260/230值≥1.0，浓度≥30 ng/μL。

•样品保存：DNA样品：可将DNA溶于Nuclease Free 超纯水中，-20℃保存。

样品保存期间避免反复冻融。