shRNA详细原理及引物设计
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shRNA 克隆原理及引物设计
一．DNAoligo设计
1.来源：1）文献报道（优先考虑）
2）网站
利用网站提供的软件设计DNAoligo：
主要使用网站有3个, 老师认为不同算法得到重合的序列比较可靠, 故三者应综合使用
网站:
http://genomics.jp/sidirect/
/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx
/techlib/misc/siRNA_finder.html
举例：HEXIM1shRNA设计
A: siDirect
输入accession number, 点”retrieve sequence”, 得到完整序列. 或直接输入序列
设置只要将"contiguous sequences to avoid-A's or T's" 选上, 如图下
点design siRNA
结果: 页面一次只显示100个碱基(如1-100), 需要点击所需段来查看
优先选择“Effective, Both strand”, 但“Effective, Plus strand”也可用
显示的序列23个碱基, 应去头尾各2个, 取中间19位碱基
B: Dharmacon
输入accession number, step 4中选blast, database选human
点”design siRNAs” orf, 应选择此范围内的序列 点击各个按钮查看各段碱基
结果: 优先选择score高, mismatch为3或大于3, 且不要化学修饰的序列
C: Ambion
序列可由SiDirect或其他位置粘贴过来,
设置中选中”4. Sequence constraints to avoid: 4 or more A's or T's in a row”,
点submit 基因含碱基异构体时使用
结果: 本网站生成的序列全部以AA开头, 后19位为所要序列
最终结果
完全重合很难实现, 所以也接受小部分不重合.
举例: 得到以下结果,
1. TT CAACAGCTGGGCAAGTTTA AG
1619
AA CAGCTGGGCAAGTTTAA GG
1622
Matched by SiDirect, Dharmacon (1619) and Ambion (1622) 然后随便选择一段, CAACAGCTGGGCAAGTTTA (起点1621) 或CAGCTGGGCAAGTTTAAGG (1624)均可
标注为”sh+基因+起点” 如: shPRKD1-2616
注：由于所设计的每个oligo并不都具有knockdown效果，针对每个protein设计oligo时，一般设计4-5个不同的oligo序列以便筛选。
2．shRNA设计model
shRNA design Model
A. New pSUPER-BX and pSR-H1 shRNA design model: BamHI-XhoI site
sh F: 5’-GATCGGG TTCAAGAGA TTTTTC-3’
sh R: 5’-TCGAGAAAAA TCTCTTGAA CCC-3’
Example:
shCdk2-85 F: GGTGGTGGCGCTTAAGAAA R:TTTCTTAAGCGCCACCACC
shCdk2-85F: GATCGGGGGTGGTGGCGCTTAAGAAATTCAAGAGATTTCTTAAGCGCCACCACCTTTTTC
shCdk2-85R: TCGAGAAAAAGGTGGTGGCGCTTAAGAAATCTCTTGAATTTCTTAAGCGCCACCACCCCC
B. Old pSUPER shRNA design model: BglII-HindIII site
sh F: GATCCCC TTCAAGAGA
TTTTTA
sh R: AGCTTAAAAA TCTCTTGAA
GGG
Example:
shCdk2-85 F:GGTGGTGGCGCTTAAGAAA R:TTTCTTAAGCGCCACCACC
shCdk2-85F: GATCCCCGGTGGTGGCGCTTAAGAAATTCAAGAGATTTCTTAAGCGCCACCACCTTTTTA
shCdk2-85R: AGCTTAAAAAGGTGGTGGCGCTTAAGAAATCTCTTGAATTTCTTAAGCGCCACCACCGGG
二．合成后DNAoligo的溶解
1）DNAoligo溶解前， 13000rpm离心3min。（由于合成的DNAoligo为粉末状态，且管内处于真空状态） 2）用经高压灭菌后的ddH2O将DNAoligo定量至3μg/μl。
ddH2O的体积(V/μl)=DNAoligo的质量（mg）×1000／3
注：所取ddH2O的体积尽量准确。
3）常温放置30min，使DNAoligo充分溶解。
三．DNAoligo的退火
1）退火体系（50μl）
正向DNAoligo（F）: 1μl
反向DNAoligo（R）: 1μl
10×退火Buffer ： 5μl
ddH2O ： 43μl
2）用石蜡膜将EP管口封好。
3）将EP管放入事先煮沸的电磁锅中，煮沸4min。
4）关闭电源，将电磁锅放入泡沫箱中保温。（为使温度缓慢下降，以便正反向oligo充分退火）
5）待锅中的水温降至常温，将EP管取出进行连接实验或置于-20℃冰箱中保存。
四．pSR-H1载体的XhoⅠ和BamHⅠ双酶切
1）酶切体系（50μl）
pSR-H1质粒： 5μg
XhoⅠ（NEB） ： 2μl
BamHⅠ（NEB） ： 2μl
BamHⅠBuffer: 5μl
BSA(100×) : 0.5μl
ddH2O : 35.5μl 2)混匀，用离心机将液体甩入管底。
3）37℃恒温水浴锅中反应过夜（至少12h，否则可能酶切不完全）。
五．酶切产物的胶回收（GE胶回收试剂盒）
1）电泳：配制1%的琼脂糖凝胶，150V电泳45min.
2)切胶：用吸水纸将凝胶上的电泳液吸干，干净的刀片在紫外灯下切出目的条带（胶块尽可能小）。
3）称量：将切好的胶块放入1.5ml的EP管中，称其重量并做好标记。
4）溶胶：用枪头将胶块搅碎，按100mg加100μl的capture buffer
type 2的比例向EP管中加入capture buffer type 2，于60℃水浴中放置10min，期间颠倒离心管3次使胶块充分溶解。
5）离心：将溶胶液转至事先准备好的柱子中，放置3min，6000rpm离心1min。
6)洗涤：向柱子中加入500μl Wash Buffer，6000rpm离心1min。
7）洗脱：将柱子套置干净的离心管中，向中央加入15μlddH2O，13000rpm离心1min，收集流出液。
8）重复步骤7.
9）-20℃保存，待用。
六．酶切后的pSR-H1和退火oligo的体外连接
