斑点杂交

35cycles
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
4.洗膜 ： 50ml塑料管
B液 40ml
42预热
取出膜条，置于 50ml塑料管中
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
⑵PCR的反应动力学： PCR的三个反应步骤反复进 行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩 增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的 拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循 环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际 反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序 列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐 积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入 线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种 效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的 种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数 情况下，平台期的到来是不可避免的。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧 核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然 复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高 温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链 或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物 结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)： 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引 物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就 可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环 的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目 的基因扩增放大几百万倍。

膜—反向斑点杂交技术检测肺结核患者肺组织和肺泡灌洗液中的结核杆菌目的探讨膜-反向斑点杂交技术（RDB）在病理石蜡组织和肺泡灌洗液检测结核杆菌的临床应用价值。

方法以97例病理石蜡组织、97例肺泡灌洗液为研究对象，分别以膜-反向斑点杂交、实时荧光PCR（RT-PCR）、抗酸染色三种方法检测结核杆菌，对三种方法进行方法学评价。

结果结核组病理石蜡组织、肺泡灌洗液三种方法检测的总阳性率分别为：抗酸染色为32.8%，RT-PCR阳性率为82.8%，RDB阳性率为89.9%，两两比较差异均有统计学意义（均P 0.05），具有可比性，分别用RDB、PCR、抗酸染色三种方法检测病理石蜡组织及肺泡灌洗液结核杆菌，比较三种方法的检测情况。

1.2 诊断标准肺结核的诊断参考原卫生部制订诊断标准[3]，结合患者临床症状、X线、纤维支气管、实验室检查及抗结核治疗的有效性确诊。

1.3 方法1.3.1 抗酸染色镜检试剂由厦门迈威生物有限公司提供，肺泡灌洗液离心涂片，石腊切片脱腊水洗，石碳酸品红初染，70℃孵育30 min，0.5%盐酸酒精脱色1 min，0.5%亚甲蓝复染30 s，水洗，无水酒精脱水，二甲苯透明，封固。

高倍镜检，抗酸阳性菌呈红染，微细杆状，可分布于巨噬细胞内外。

1.3.2 实时荧光PCR试剂由中山达安基因生物有限公司提供，基因扩增仪为ABI7300，样本预处理严格按试剂说明书操作，扩增条件：93℃ 2 min预变性，93℃45 s（变性）、55℃120 s（退火、延伸）为一循环，共计40循环（后30循环记录荧光信号），结果判定，CT值30为阴性。

1.3.3 膜-反向斑点杂交1.3.3.1 标本预处理采用4倍体积的4%NaOH室温下对研究标本进行液化30 min，15 000 r/min离心5 min，离心半径10 cm，去上清，并加1 mL生理盐水充分吹打混匀洗涤。

50 μL 20 g/L蛋白酶K消化，沸水浴10 min灭活蛋白酶K。

支持物不同
固相杂交
概念：参加反应的一条核酸链被预先固定 在固体支持物上，另一条反应核酸 则游离在溶液中进行的杂交反应。 固相支持物： 硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、 乳胶颗粒、磁珠、微孔板， 芯片等
固相杂交的特点：
① 杂交后，游离片段容易经漂洗除去； ② 支持物上留下的杂交物容易检测； ③ 能防止靶DNA自我复性。
WHAT DID THEY WANT TO DO?
confirm the downregulation of Nnat in pancreas of mutant BETA2 embryos How to do? Northern blot and in situ hybridization
RESULT
因此，该法最为常用。
分类： 菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、
Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、 组织原位杂交和夹心杂交等。
液相杂交
o定义： 所参加反应的两条核酸链都游离 在溶液中。 o特点： 杂交后溶液中过量的未杂交探针 难以除去，误差较高。 应用不广。
分子杂交分类
Southern
Protection of INS-1 Cells From Free Fatty Acid–Induced Apoptosis by Targeting hOGG1 to Mitochondria
Rachek et.al, Diabetes, 2006
STORY BACKGROUND
Pancreatic beta cell
核酸分子杂交
一、核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization）
指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或

应用PCR-反向斑点杂交快速鉴定分枝杆菌菌种目的:应用聚合酶链反应-反向斑点杂交法(PCR-RDBHA)快速鉴定分枝杆菌至种的水平。

方法:以分枝杆菌rpoβ基因编码序列为靶基因,应用PCR-RDBHA检测126株分枝杆菌临床分离株。

以PCR-DNA测序为对照,对经PCR-RDBHA鉴定为非结核分枝杆菌(NTM)的临床分离株进行PCR-DNA测序。

结果:126株临床分离株中,经鉴定115株(91.3%)为结核分枝杆菌复合群(MTC),11株(8.7%)为NTM。

NTM中,4株胞内分枝杆菌,1株堪萨斯分枝杆菌,1株戈登分枝杆菌,2株瘰疬分枝杆菌,3株脓肿分枝杆菌。

11株NTM PCR-RDBHA与PCR-DNA测序结果一致。

结论:PCR-RDBHA能鉴定分枝杆菌临床分离株至种的水平,方法简便、快速,结果准确,具有良好的临床应用价值。

[Abstract] Objective: To identify Mycobacterium species rapidly by polymerase chain reaction-reverse dot blot hybridization assay (PCR-RDBHA). Methods: 126 mycobacterial clinical isolates were detected by PCR-RDBHA based on the sequence of rpoβ gene. PCR-DNA sequencing of the nontuberculous mycobacteria (NTM) identified by PCR-RDBHA was performed as control. Results: Among 126 isolates, 115 (91.3%) were determined to be M.tuberculosis complex (MTC), 11 (8.7%) to be NTM which contained 4 M.intracellulare, 1 M.kansasii, 1 M.gordonae, 2 M.scrofulaceum and 3 M.abscessus. The results of 11 NTM identified by PCR-RDBHA were in agreement with PCR-DNA sequencing. Conclusion: It is simple, rapid, accurate and valuable in clinical application that PCR-RDBHA is applied to identify mycobacterial clinical isolates to species level.[Key words] Mycobacterium; Species identification; Polymerase chain reaction; Reverse dot blot hybridization assay目前,常规的分枝杆菌菌种鉴定需采用分枝杆菌培养物进行生长特性试验(生长速度、生长温度、光产色试验、多种鉴别培养基上生长试验)及生化特性试验(耐热触酶试验、硝酸盐还原试验、烟酸试验、吐温-80水解试验、尿素酶水解试验、芳香硫酸酯酶试验、铁离子吸收试验、亚硝酸盐还原试验)等10余项试验,综合分析判定结果[1],方法复杂、费时,慢生长分枝杆菌需3～4周方可获得结果,且准确度较差,难以满足临床诊断和治疗的需要。