斑点印迹杂交ppt课件

斑点印迹原理、操作步骤及应用一、原理斑点印迹（dot blot）是一种定性检测核酸或蛋白质的技术，其基本原理是硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，在中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子，因而将抗原吸附于纤维素膜后，就可利用纤维素膜作为固相载体进行抗原-抗体反应。

当加入抗体后即可与膜上的抗原结合，然后再加入带有标记物的抗体，使标记通过抗抗体和相应抗体的结合间接地交联于纤维素膜上。

加入标记物相应的底物后，标记物即可与底物作用形成不溶性产物，呈现斑点状着色，从而判定结果。

二、材料免疫斑点印迹所需的材料包括硝酸纤维素膜（或尼龙膜、NC膜），PBS缓冲液，抗原、抗体、标记二抗、相应底物，洗涤液、封闭液，37℃湿盒和温箱。

三、操作步骤免疫斑点印迹根据所用的二抗标记物不同，又可分为：①辣根过氧化物酶免疫斑点试验；②碱性磷酸酶免疫斑点试验；③金银染色免疫斑点试验（使用胶体金作为抗抗体的标记物）等。

其中最常用的是以辣根过氧化物酶标记系统为基础的免疫斑点试验。

具体操作步骤如下：1.抗原包被将0.01mol/L PBS pH 7.4稀释的已知抗原液2μl点于硝酸纤维素膜（或醋酸纤维素膜）上，置37℃温箱中干燥20～30分钟。

2.封闭滴加封闭液37℃温盒中封闭10分钟，用洗涤液洗1～2次，滤纸吸干。

3.抗原抗体结合加用稀释液稀释的抗体或待检标本，置37℃湿盒中30分钟。

4.洗涤用洗涤液震洗3次×3分钟、吸干。

5.加酶标二抗加入经过辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或胶体金标记的抗抗体，孵育、震洗、吸干。

6.显色加相应标记抗抗体的底物溶液显色5～10分钟，终止反应，观察结果。

四、注意事项免疫斑点印迹要求包被的抗原处于最适浓度，多以蛋白质含量500～1000μg/ml为宜。

浓度过高可出现假阳性，过低则降低试验的敏感性。

注意酶结合物的浓度，最适浓度常与包被抗原浓度有关，应根据试验具体条件作方阵滴定来确定。

固相杂交又可分为斑点杂交、凝胶电泳印迹转移杂交。

而反向斑点杂交(reverrsedotblot，RDB)是Saiki等提出的一种斑点杂交技术，该技术较正向斑点杂交和凝胶电泳印迹转移杂交具有快速、简便、高敏感性、特异性强的特点，尤其是基因分型、基因突变检测，病原体的检测等方面有其独特的优势。

反向斑点杂交法利用生物素等标记的探针和特异性扩增PCR产物(靶DNA序列)杂交。

但是不同于一般的斑点杂交。

一般的点印迹杂交是靶DNA固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，标记的探针和靶DNA杂交显色。

这种方法每次杂交反映只能判断待测DNA是否含有某一种探针的同源序列，对于某些基因座位可能含有十几至几十个等位基因(如HLADRB位点或地中海贫血突变基因等)，用这种点杂交方法就会很繁杂，甚至可能做不到。

而RDB正是解决了这一难题。

RDB是先将待用的探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，每个探针一个点并编上号，再将待测的DNA样本(一般是经PCR特意性扩增的产物，在PCR引物5’端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交，这样待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。

这样一次就可以判断某
一基因座位的大部分或全部等位基因，因此利用这样的工作原理还可以用于基因分型、病原体检测、肿瘤研究等。