野生甜瓜MLO基因突变体对白粉病菌的抗性分析_程鸿
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园艺学报，2015，42 (8)：1515–1522. Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0119；http：//www. ahs. ac. cn 1515
收稿日期：2015–04–01；修回日期：2015–07–28 基金项目：国家自然科学基金项目（31360434，31471896，31301795）；甘肃省生物技术专项（GNSW-2012-13）；农业部园艺作物生物学与种质创制西北地区科学观测实验站项目 * E-mail：chengjn@yeah.net
野生甜瓜MLO基因突变体对白粉病菌的抗性分析 程 鸿1,*，孔维萍1，吕军芬2，李继平3 （1甘肃省农业科学院蔬菜研究所，兰州 730070；2甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070；3甘肃省农业科学院植物保护研究所，兰州 730070）
摘 要：以野生和栽培甜瓜为试材，通过人工接种白粉病菌，对两份材料的抗性进行了鉴定，结果表明野生种质对甜瓜白粉病菌生理小种Race1具有抗性。基因测序发现野生种质与栽培品种的MLO基因序列相差85个碱基。进一步利用荧光标记的农杆菌介导法将CmMLO2基因在野生种质中表达，白粉病菌能够感染阳性转化植株，说明CmMLO2突变使野生种质缺失MLO蛋白，导致对白粉病的负调控作用被解除，从而启动了对白粉病菌的广谱抗性。 关键词：甜瓜；CmMLO2；突变；白粉病 中图分类号：S 652 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）08-1515-08
Analysis of Powdery Mildew Resistance in Wild Melon MLO Mutant CHENG Hong1,*，KONG Wei-ping1，Lü Jun-fen2，and LI Ji-ping3 （1Institute of Vegetable，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070，China；2College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；3Institute of Plant Protection，Gansu Academy of
Agricultural Sciences，Lanzhou 730070，China）
Abstract：The resistance of cultivar and wild species had been identified used the method of leaves inoculate with Podosphaera xanthii. The results showed that the wild germplasms were resistance to Podosphaera xanthii Race1. There were 85 bp differences between wild and cultivated species after cloning and sequence analysis of their MLO gene. Then CmMLO2 was expressed in wild germplasm using fluorescence-labeled Agrobacterium-mediated method. A positive transgenic plant was successful invasion by Podosphaera xanthii Race1. These results suggested that wild species maybe failing encoded MLO protein，resulting the function of MLO negative regulation to Podosphaera xanthii was losing，which caused wild species had a broad-spectrum resistance to Podosphaera xanthii. Key words：melon；CmMLO2；mutation；Podosphaera xanthii
中国是甜瓜（Cucumis melo L.）生产大国（刘君璞，2003）。甜瓜生产中白粉病常造成很大危害（程振家 等，2006）。选育抗白粉病品种是防治甜瓜白粉病的有效途径，挖掘和利用甜瓜抗白粉病基因是进行抗病育种的前提和基础。 MLO是植物特有的一类家族基因（Panstruga et al.，2005a）。研究发现大麦中MLO基因的隐性 Cheng Hong，Kong Wei-ping，Lü Jun-fen，Li Ji-ping. Analysis of powdery mildew resistance in wild melon MLO mutant. 1516 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (8)：1515–1522.
突变mlo对所有白粉菌具有广谱抗性，在欧洲野生大麦mlo突变体作为育种资源被广泛应用（Lyngkjaer et al.，2000）。程鸿（2009）从甜瓜中克隆了3个MLO基因，分别命名为CmMLO1、CmMLO2和CmMLO3，其中CmMLO2和拟南芥的AtMLO2、AtMLO6和AtMLO12具有较近的遗传进化关系。生物信息学分析发现，CmMLO2属于典型的MLO基因，编码7TM跨膜蛋白。表达分析结果证明其具有组织特异性，CmMLO1主要在子叶和花中表达，CmMLO2在真叶中表达量相对较高（Cheng et al.，2012，2013），CmMLO3则主要在幼果、根及花中表达。在白粉病诱导后，CmMLO2在叶片中的相对表达量显著高于其它两个同源基因。 除大麦（Jφrgensen，1992）、拟南芥（Devoto et al.，1999）和甜瓜之外，在番茄（Bai et al.，2008），月季（Kaufmann et al.，2012）、水稻（Elliott et al.，2002）和大豆（Shen et al.，2012）等作物中相继发现MLO基因。无论是利用反义干扰阻止MLO表达、通过诱变技术获得新的mlo种质还是天然突变材料，均具有对白粉病的广谱抗性（Panstruga，2005b）。作者在对一份野生甜瓜种质进行抗病筛选时发现其对白粉病具有抗性，为了进一步明确这种抗性是否与MLO基因关联，采用人工接种
方法研究野生材料和栽培品种对白粉病菌的抗性反应，通过对比两种材料CmMLO2基因的序列差异，构建CmMLO2-GFP融合基因转化载体，对野生突变体进行功能分析，旨在为甜瓜白粉病抗病育种提供思路。
1 材料与方法 1.1 材料培养与处理 G24为易感白粉病的甜瓜栽培品种（Cucumis melo L.），C18为抗病野生种（C. chate），都属于高代自交系。催芽后播于塑料营养钵中，置于人工气候箱内生长，夜间18 ℃，白天 25 ℃。苗龄至四叶期时，采集甘肃省分布最广的单囊壳白粉病菌（Podosphaera xanthii）的生理小种Race1，在无菌室利用压片接种法（刘东顺 等，2010）接种，3 d后待感病材料叶片出现粉斑时进行显微观察和RNA提取。
1.2 白粉病菌侵染叶片的细胞学观察 参考杨瑞等（2013）的方法，用吸耳球轻拂叶片表面，将叶片切成5 mm × 5 mm左右的小块，以0.1 mol · L-1磷酸缓冲液（pH 7.2）的配制的2.5%戊二醛固定，在室温下抽气直至材料下沉，4 ℃
冰箱中继续固定24 h。用0.1 mol · L-1磷酸缓冲液洗涤15 min，用1%锇酸固定4 h，经过梯度乙醇脱水，丙酮过渡，使用英国K-850型零界点干燥仪干燥，日立E-1010型离子溅射仪镀膜。利用TESCAN5136型扫描电子显微镜观察并拍照。加速电压20 kV。
1.3 基因克隆和序列分析 利用北京天根Trizol试剂盒提取叶片总RNA。SmartTM RACE cDNA Amplification Kit合成cDNA
（方法参照Clontech试剂盒说明）。根据作者之前发表的MLO基因序列，用Premier5.0软件设计扩增引物MloF：5′-GCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAG-3′，MloR：5′-GTATTTGCTGCTGCCCT GTACATGA-3′。以cDNA第一链为模板扩增获得MLO全长序列。反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸 50 s，25个循环；72 ℃延伸10 min。1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，采用离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。回收产物与程 鸿，孔维萍，吕军芬，李继平. 野生甜瓜MLO基因突变体对白粉病菌的抗性分析. 园艺学报，2015，42 (8)：1515–1522. 1517
PGEM-T easy vector（Promega）连接，转化大肠杆菌TOP10。菌落在含有 X-gal和IPTG的平板上进行蓝白斑筛选。分别挑选若干白斑菌落扩大培养后分别提取质粒，通过质粒DNA酶切和PCR鉴定后，选择阳性单克隆PCR产物送上海生工进行测序，用DNAMAN软件对两份材料的cDNA序列进行比对分析。
1.4 荧光标记转化载体的构建 利用pROK2和绿色荧光蛋白pjit163GFP载体构建CmMLO2的转化载体。首先设计引物扩增CmMLO2编码区，添加BamHⅠ和SalⅠ酶切位点。为了形成融合荧光蛋白，将终止密码子TGA突变为GGA。CmMLO2-F：5′-TAGGATCCATGGCTGAATGTGGAACAG-3′，CmMLO2-R：5′-CTGTCGA CTCCTTTGGCAAATGAGAAG-3′。然后以质粒pjit163GFP为模板，扩增GFP编码区，同时添加SalⅠ和KpnⅠ酶切位点。引物GFP-F：5′-TAGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3′，GFP-R：5′-GCGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCC-3′。最后利用PCR扩增CmMLO2和GFP片段，然后分别连入pGEM-T easy载体，通过测序验证后提质粒，分别用SalⅠ酶切，T4连接酶过夜连接，再次
