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酸菜食品发酵中防腐乳杆菌的检测与筛选摘要：本实验采用单层牛津杯叠法，对酸菜汁中的防腐乳杆菌进行检测及筛选，得到一株优势抑菌乳酸菌，该菌具有良好的抑菌特性，对改良发酵酸菜品质、延长酸菜产品保质期具有重大意义。
关键词：酸菜加工;防腐;乳杆菌;检测1前言发酵果蔬是日常饮食的一部分，具有很高的经济重要性。
然而微生物的生长繁殖造成这类产品的腐败也是发酵果蔬行业上的一个主要问题。
通常认为乳酸菌是安全的，乳酸菌被广泛应用在各类食品中，其生理功能和特点在食品加工中发挥了重要作用它们在食品工业中的使用有助于减少添加化学防腐剂和强化热处理，迄今为止，只有乳酸链球菌素是食品级细菌素。
乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类形态、代谢性能和生理学特征不完全相同，可发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌的统称，乳酸菌代谢产生有机酸，如乳酸，乙酸和丙酸作为碳水化合物代谢的发酵终产物。
据Ross等报道称，这些弱有机物产酸导致酸性环境，抑制细菌和真菌，包括许多致病微生物和腐败微生物的生长，而Batish等【1】研究发现这些弱有机酸的抗菌作用归因于将pH降低至低于未分解有机物生长和代谢抑制范围的水平。
研究报告表明乳酸菌有益人体健康，同时这些有益乳酸菌在食物中有很长的使用历史，它们产生一些拮抗性化合物，特别是能够控制病原菌和有害的腐败菌群，使用乳酸菌来控制霉菌生长是物理和化学方法的替代，因为这些细菌已经被报道具有强的抗微生物性质。
研究发现一些复配防腐剂易引起致癌、致畸、致突变和引起食物中毒等问题，其使用量越来越受到众多国家的限制。
同时从多地区多厂家的酸菜质量抽查报告中显示，不合格样品屡屡增多，为防止微生物超标而滥用或超剂量使用防腐剂是其主要原因。
因此，在保证酸菜品质的同时，如何安全、规范的使用防腐剂来延长其保质期成为了酸菜行业中函待解决的问题，同时也是成为国内外食品安全领域的研究热点。
近几年来，为防止食品及农产品产前、产后的腐败变质，主要的解决方法是添加化学防腐剂，用于防止食品在储存【2】、流通过程中主要由微生物繁殖引起的变质而使用的食品添加剂，李佰秋等【3】，研究Nisin与植酸复配对腌制蔬菜中G+腐败菌的抑制效果。
乳酸菌菌种的分离筛选原理乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的益生菌，广泛应用于食品、饲料、医药等领域。
乳酸菌菌种的分离筛选是乳酸菌应用研究中的重要一环，其目的是从大量的混合菌群中筛选出具有优良特性的菌株。
乳酸菌菌种的分离筛选原理主要包括以下几个方面：1. 选择合适的培养基：乳酸菌菌种对营养要求较高，因此选择适宜的培养基是分离筛选的首要步骤。
常用的培养基有MRS培养基、DC培养基等，它们含有适宜乳酸菌生长的营养成分，能提供所需能量和营养物质。
2. 适宜的培养条件：乳酸菌对培养环境的温度、pH、氧气和二氧化碳等条件有一定要求。
通常情况下，乳酸菌分离筛选需要在适宜的温度（一般为30-40）下进行，pH值保持在4.5-7.0之间，氧气和二氧化碳含量适中。
3. 分离方法：乳酸菌菌种的分离常采用传统的分离培养技术，如层析法、稀释平板法、摇瓶培养法等。
其中，层析法是一种常用的快速分离方法，通过将混合菌群在筛选培养基上涂抹或刺激，使不同菌株在筛选培养基上形成分离的菌落。
4. 鉴定鉴别：乳酸菌菌种的筛选与鉴定是不可分割的一步，只有确定菌株的种属和特性才能真正确认其乳酸菌的菌种类型。
目前，常用的鉴定方法包括形态学观察、生理和生化特性检测、分子生物学方法（如PCR技术、16S rDNA序列分析）等。
在乳酸菌菌种的分离筛选过程中，还需要注意以下几个问题：1. 选择样品：样品的选择对于乳酸菌菌种的分离筛选至关重要。
通常情况下，从乳制品、肠道、土壤等环境中寻找潜在的乳酸菌菌种，可以提高分离到优良菌株的几率。
2. 优化培养条件：对于特殊的乳酸菌菌种，可能需要优化培养条件，如调整温度、添加特定的营养成分等，以促进其生长和繁殖。
3. 评价筛选结果：乳酸菌菌种的分离筛选结果需要综合考虑其特性和应用价值。
如菌株的酸奶生产能力、耐酸碱能力、抗菌能力、抗氧化能力等。
总结起来，乳酸菌菌种的分离筛选原理主要包括选择合适的培养基和培养条件、采用适当的分离方法和鉴定鉴别技术。
乳酸菌的分离与筛选具体实验流程1. 引言1.1 背景介绍乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的细菌，它们能够以乳酸为代谢产物进行无氧发酵，并且在食品工业、农业和医学领域具有重要的应用价值。
乳酸菌不仅能够促进食品品质的改善和保鲜，还对人体健康具有积极影响。
然而，目前市面上存在许多商业化的乳酸菌制剂，其有效成分及效果并不尽相同。
因此，研究和筛选出优质活性的乳酸菌种类，具有重要意义和广阔前景。
1.2 研究意义本研究旨在通过分离与筛选方法得到高活性的乳酸菌。
通过该研究可以加深我们对乳酸菌及其作用机制的理解，并为特定领域如食品工业、农业等提供先进的技术支持和解决方案。
此外，筛选出具有优良特性的乳酸菌株也将为开发新型功能性食品、生物农药等领域的产品提供重要支持。
因此，本研究对于推动食品工业、农业发展具有积极意义。
1.3 实验目的本实验主要目的如下：- 收集和处理样品：收集富含乳酸菌的样品，并经过适当处理以提高分离效果。
- 选择与制备分离培养基：根据乳酸菌的特性选择适合的培养基并进行制备。
- 设定分离培养条件：通过调控温度、pH值等参数，确定适宜的乳酸菌分离培养条件。
- 鉴定活性乳酸菌指标：确定评价乳酸菌活性和质量的指标，并进行相关试验和检测。
- 设计与实施筛选试验：根据所选指标设计筛选试验，并在实验中采用相应方法进行实施。
- 可行性评估与结果分析：对筛选试验结果进行评估和分析，并总结可行性及相关优化建议。
通过以上实验流程，我们旨在深入了解乳酸菌的特点及其在不同领域中应用潜力，并为进一步研究和开发具有市场竞争力的乳酸菌产品提供理论和实践基础。
2. 乳酸菌的分离方法2.1 样品收集与处理在乳酸菌的分离研究中，样品的选择和处理十分重要。
我们可以选择不同来源的样品，如发酵食品、生态环境等。
收集样品后，需要进行适当的处理以消除非目标微生物对于乳酸菌生长和筛选的干扰。
常见的样品处理方法包括冷藏、过滤、稀释等。
2.2 分离培养基选择与制备为了促进乳酸菌的分离和生长，在实验中需要选择适宜的分离培养基。
精心整理对从中国四川泡菜中分离的乳酸菌进行识别和鉴定泡菜是传统的发酵蔬菜产品,在中国的四川省很受欢迎。
本文研究的目的是通过分析来自四川省6个不同地区的36个样品来调查主要物质乳酸菌在泡菜中的多样性(实验室)。
这些样品的实验室计数的记录是从3.90到8.40cfuml-1。
使用MRS琼脂培养基，从这些样本中获得总共有185个假定的革兰氏阳性实验室和过氧化氢酶缺乏的属性,这些菌株被发现在物种水平生理测试上，16srRNA基因测序和PCR扩增鉴定。
结果显示,所有的所分离的乳酸菌都准确地确定为肠球菌thailandicus(2株)、乳杆菌(16株),l.短(24株),l.paracasei(9株),l.杆菌(81株),l.pentosus(38株),l.sakei(8株),l.spicheri(1株)、乳酸明串珠菌(1株)和片球菌属ethanolidu-rans(5株)。
四川泡菜的主要实验室l.杆菌，它是从大多数样本中分离的。
结果还表明,来自四川省泡菜,,。
对在天(约°°C到16.4），室温下，泡菜汁的样品收集时间为15分钟,在冰上进行2-5h运输和样品到达实验室后立即进行了微生物分析。
计数和隔离的实验室稀释是1毫升的泡菜汁加9毫升生理盐水(0.9%氯化钠)。
进一步连续稀释10倍，范围是10-5到10-9，在实验室进行处理和测定，使用布朗甲酚紫(BCP琼脂、Nissui制药、To-kyo、日本)厌氧30°C孵化2天，平板在30°C用灭菌锅罐进行灭菌，(巴尔的摩生物实验室,GasPak100厌氧系统,BD生物科学,火花,医学博士,美国)。
菌落是从MRS培养基上随机地挑取，每个平板含有30-300个菌落，（ManRogosaSharpe液体培养基，丙烯酰胺），并转移到5ml的MRS液体培养基中，选中平板上的菌落在MRS培养基上进行反复纯化，革兰氏阳性和过氧化氢阴性酶是从纯化的平板中提取，在-80°C，10%(w/v)脱脂牛奶进行冷冻储存。
发酵食品中乳酸菌的分离与鉴定乳酸菌是一类重要的微生物，在食品发酵过程中扮演着不可替代的角色。
乳酸菌不仅能够提高食品的营养价值，还具有促进肠道健康、增强免疫力等益生作用。
因此，分离和鉴定发酵食品中的乳酸菌是食品科学领域中的一项重要研究内容。
要进行乳酸菌的分离与鉴定，首先需要从发酵食品样品中分离乳酸菌。
一般而言，我们可以选择将样品通过稀释后接种于选择性培养基上，以便只有乳酸菌能够生长。
接种后，将培养基放置于适宜的温度下，培养一段时间。
乳酸菌具有较强的酸性产生能力，因此在培养过程中会形成明显的酸性环境。
可通过测量培养基的pH值来初步判断是否有乳酸菌生长。
在分离乳酸菌的培养基上，我们可能会观察到许多不同形态的菌落。
这些菌落在形状、颜色、质地等方面可能存在差异。
我们可以选择几个具有代表性的菌落进行后续的鉴定。
对于乳酸菌的鉴定，有许多方法可供选择。
一种常用的鉴定方法是形态学观察。
乳酸菌具有一些特征性的形态特征，如菌落的形状、边缘的特点、质地的柔软程度等。
此外，乳酸菌的细胞形态也具有一定的特征，如形状、大小、胞内结构等。
通过在显微镜下观察乳酸菌的形态特征，可以初步判断其种属。
除了形态学观察外，乳酸菌的生理生化特性也是鉴定的重要依据。
例如，乳酸菌通常能够在不产生气体的条件下发酵葡萄糖。
此外，乳酸菌对于一些特定的碳源、氮源等具有较强的利用能力。
通过对乳酸菌进行代谢特性的测试，可以进一步确认其种属。
分子生物学方法也为乳酸菌的鉴定提供了新的手段。
通过对乳酸菌的DNA进行提取和PCR扩增，可以得到乳酸菌的16S rRNA序列。
将这些序列与已知种属的乳酸菌进行比对，可以准确鉴定乳酸菌的种属。
在发酵食品中，常常存在多种乳酸菌同时存在的情况。
因此，对于从发酵食品中分离到的乳酸菌，进行种属鉴定是至关重要的。
只有确定了乳酸菌的种属，才能更好地利用其在食品工业中的潜力。
发酵食品中乳酸菌的分离与鉴定是一项科学而有趣的工作。
通过对乳酸菌的研究，我们可以更好地了解乳酸菌在食品发酵过程中的功能和作用，为食品工业的发展提供更多的可能性。
酸菜中乳酸菌分离鉴定的研究进展作者：李晓忱来源：《品牌与标准化》2016年第02期【摘要】随着生活水平的逐步改善，人们对食品多元化的追求也日趋提高，经乳酸发酵制得的食品以其口感独特种类繁多等特点广受好评。
特别是在我国的东三省，酸菜作为传统发酵蔬菜制品之一，以其独特的口感、久食不腻的特点深受人们青睐。
其汁液中富含的乳酸菌活菌成分作为酸菜发酵过程中主要的发酵菌之一，近年来也受到食品业的广泛关注，关于乳酸菌的各项研究也层出不穷，本文将对乳酸菌的研究现状进行阐述，包括乳酸菌的定义和分类、乳酸菌的分离鉴定方法，同时也会对该菌种在发酵生产中的作用机理和发展趋势加以简要分析。
【关键词】酸菜乳酸菌分离鉴定【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2016.02.0041 乳酸菌的定义及分类乳酸菌是分解发酵性糖类来供应自身能量同时伴有大量乳酸生成的一类微生物的统称。
此外，形态学方面还对其有如下描述：乳酸菌细胞呈革兰氏阳性，多为球状或杆状，无内生孢子，当葡萄糖消耗量超过50%时产生乳酸[1]。
截至目前，科学家已经确认的乳酸菌可划分出至少23个属56个种。
主要包括：乳杆菌属、肉食杆菌属、酒球菌属、环丝菌属、球菌属、链球菌属、片球菌属、明串珠菌属、气球菌属、奇异菌属、有球菌属、李斯特氏菌属、乳球菌属、孢乳杆菌属、芽孢杆菌属中的少数种、双歧杆菌属、丹毒丝菌属、孪生球菌属、糖球菌属、四联球菌属、乳球形菌属、魏斯氏菌属和营养缺陷菌属[2][3]。
其中，乳杆菌属中的保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌合链球菌属中的嗜热链球菌等常常被应用到乳制品的发酵中，植物乳杆菌、短乳杆菌、明串珠菌属的肠膜明串珠菌常被应用于蔬菜的发酵中。
2 酸菜与乳酸菌众所周知，酸菜是包括中国在内等诸多国家一年四季都在食用的一种发酵类食品。
酸菜可根据其发酵基物的不同来分类，例如由大白菜或圆白菜等发酵制得。
酸菜的食用范围相当广泛，冬季的食用地区主要集中在东北；而我国四川地区更是把酸菜作为一年四季都在食用的一种重要食品。
食品中乳酸菌的分离鉴定与应用研究随着人们对健康的关注程度不断提升，食品安全成为人们日常生活中不可忽视的问题之一。
乳酸菌作为一类有益微生物，被广泛应用于食品工业中。
然而，食品中乳酸菌的准确鉴定与合理应用仍然是当前科学研究关注的热点。
本文探讨了食品中乳酸菌的分离鉴定方法以及其在食品工业中的应用前景，旨在为食品科学领域的研究提供参考。
在食品加工过程中，乳酸菌是一类常见的菌群，可以发酵产生乳酸，给食品赋予了特殊的风味和营养价值。
为了准确鉴定食品中的乳酸菌，科学家们普遍采用了分离纯化的方法。
首先，从食品样品中分离出潜在的乳酸菌，然后通过多重培养基和生理生化特性进行初步筛选。
接下来，通过形态学观察和生理生化试验进一步确定乳酸菌的种属分类。
最后，通过分子生物学技术如PCR和DNA测序来确定乳酸菌的亲缘关系。
这些方法的综合应用可以有效地分离鉴定食品中的乳酸菌种类。
乳酸菌的应用广泛，尤其在食品工业中展现出了巨大的潜力。
首先，乳酸菌可以用于酸奶、酸乳等乳制品的生产。
其产生的乳酸不仅可以增加产品的保存期限，还能提高食品的口感，增加食品的营养价值。
其次，乳酸菌还可以应用于面包、豆腐等发酵类食品的生产。
乳酸菌发酵能够使得食品在产生特殊风味的同时，还能使食品中的抗营养因子降低，增加人体对营养物质的吸收。
此外，乳酸菌还可以应用于腌制食品的生产，通过发酵降低盐分含量，并使食品更具咸鲜味。
乳酸菌的种类繁多，其应用潜力远未被完全挖掘。
尽管食品中乳酸菌的应用前景广阔，但是乳酸菌菌株的选择和培养条件仍然是当前研究中的难题。
一方面，不同种类的乳酸菌育种有其特殊性，如何从大量的微生物中筛选出理想的乳酸菌成为了困扰科学家的问题。
另一方面，乳酸菌的培养条件也是研究的难点之一。
乳酸菌对酸碱度、温度、营养物质等环境因素都有一定要求，因此科学家们需要不断努力来寻找适宜的培养条件。
综上所述，食品中乳酸菌的分离鉴定与应用研究是当前食品科学研究的重要方向之一。
0 浙 江 育 英 职 业 技 术 学 院 ZHEJIANG YUYING COLLEGE
毕业设计（论文） (2011届)
题 目 酸菜中乳酸菌的分离筛选与鉴定研究
分院/系 信息技术与应用系
专 业 食品营养与检测
班 级 08食品
学 号 08263101 学生姓名 俞丹
指导教师 茅小燕
日 期 2011年5月
浙江育英职业技术学院教务处 制 1
酸菜中乳酸菌的分离筛选与鉴定研究 摘要：酸菜作为东北的传统食品，历史悠久，营养丰富，口味醇厚，深受消费者的喜爱。研究表明，天然发酵酸菜中含有大量的乳酸菌，大多对健康有益。细菌素(baeteriocin)是由细菌产生的一种抗生代谢产物，含对同源种或近似种有拮抗作用的蛋白质或多肽物质。本研究从自然发酵的酸菜汁中分离出3株高产酸菌，利用经典分类法即在产乳酸、形态学、生理生化特性等方面对其进行了细菌学鉴定。结果表明，3株菌分别为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、植物乳杆菌(Lactobacillus planetarium)和肠膜明串珠菌Cleuconostoc mcscnteroides)。
关键词：酸菜汁；乳酸菌；筛选；分离鉴定 2
目 录 1 前言 ................................................................................................................. 3 2 材料与方法 ..................................................................................................... 3 2.1 材料与试剂 .................................................................................................. 3 2.2.1 材料 ........................................................................................................... 3 2.2.2 主要试剂与仪器 ....................................................................................... 3 2.2.3 培养基 ....................................................................................................... 4 2.2 方法 .............................................................................................................. 4 2.2.1 乳酸菌的分离筛选 ................................................................................... 4 2.2.2 乳酸菌鉴定 ............................................................................................... 4 3 结果与分析 ..................................................................................................... 5 3.1 乳酸的分离筛选结果 .................................................................................. 5 3.2 乳酸菌的鉴定结果 ...................................................................................... 6 3.2.1 纸层析乳酸定性结果 ............................................................................... 6 3.2.2 形态学鉴定结果 ....................................................................................... 6 3.2.3 生理生化特性鉴定结果 ........................................................................... 7 4 结论 ............................................................................................................... 10 3
1 前言 酸菜是一种独特而具有悠久历史的乳酸发酵蔬菜制品。利用乳酸菌进行发酵，加工、贮存蔬菜的方式已有几千年的历史了[1]，并在全世界许多国家和地区广为流传。不仅是因为其简便、易掌握，而且还因为其能进一步改善蔬菜风味、增进食欲[2]。我国蔬菜资源丰富，酸菜作为我国东北地区一种传统的乳酸发酵蔬菜制品，其口感清爽，营养丰富，风味独特[3]。其汁液中富含乳酸菌活菌，赋予酸菜多种营养保健功效[4]。对其深入研究且开发利用，对提高人民健康水平、开发蔬菜加工品种、蔬菜原料的综合利用有着积极意义。 本研究旨在对传统自然发酵的酸菜进行乳酸菌的分离鉴定，为酸菜的纯菌发酵和现代工业化生产奠定基础。
2 材料与方法 2.1 材料与试剂 2.2.1 材料 大白菜、食盐。 2.2.2 主要试剂与仪器 试剂：蛋白胨、酵母膏、吐温一80，牛肉膏、琼脂、乳酸、K2HP04、柠檬酸三铵、乙酸钠、葡萄糖、MgS04·7H20、MgS04·4H20、丁醇、甲酸等。 仪器：恒温培养箱，生化培养箱，奥林巴斯显微镜，731分光光度计，超净工作台，电热手提式高压杀菌锅，酸度计，电子天平。 4
2.2.3 培养基[5] 乳酸菌分离固体培养基，MRS培养基，用于肠膜明串珠菌的Ⅲ谴择性培养基，PY基础培养摹，PYG琼脂培养基。
2.2 方法 2.2.1 乳酸菌的分离筛选 取味道纯正的自然发酵酸菜汁为分离样，稀释后于双层乳酸菌分离固体培养基中370℃培养48h，挑取溶CaCO3，圈较大、培养基变黄的菌落，划线分纯。 产酸量测定：采用0.1mol／L的NaOH碱液滴定法，以酚酞为指示剂，分析结果以乳酸计。 产酸量=N×V1×0.09∕V2×100％ 式中N为氢氧化钠的浓度；V1为用氢氧化钠的体积；V2为样品的体积。
2.2.2 乳酸菌鉴定 产乳酸鉴定：通过纸层析乳酸定性试验确定出产乳酸细菌。纸层析法：新华l滤纸，溶液系统为正丁醇：甲酸：水=80：15：5，色剂为0.04％溴酚蓝已乙醇溶液，0.1mol／LNaOH调pH值为6.7，乳酸标准溶液浓度为2％，标准液、各菌株发酵液以毛细管点样上行层析，显色比较各斑点的R／r值。 形态学鉴定：将分纯的菌种分别涂到Ⅻ随琼脂培养基上，37℃培养24h，观察菌落特征，取典型菌落涂片革兰氏染色，油镜下观察菌体形态。 生理生化特性鉴定：(1)生化特性研究：对分离的菌种分别进行糖发酵产酸试验、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、产生吲哚(靛基质)试验、明胶液化试验、硫化氢产生试验、葡聚糖产生试验。(2)生理特性研究a生长曲线的绘制：将1℅的相应菌液接入培养基中，每隔4h吸取菌液做系列梯度稀释，作混合平板，L-6于28℃，L-7和L-8于37℃培养2d-3d，菌落计数。以培养时间为横坐标，菌落总数的对数为纵坐标，绘制生 5
长曲线。b培养温度及时间对菌株生长的影响，OD值以同温下不接种培养基作对照，定期取出接种培养基在波长为600nm。测定c运动性检查：采用半固体培养基穿刺法[6]。
3 结果与分析 3.1 乳酸的分离筛选结果 经分离筛选，得L-1、L-2、L-3、L-4、L-5、L-6、L-7、L-8、L-9菌株。结果见表3-1。
表3-1 乳酸菌的分离与筛选结果 项目 L-1 L-2 L-3 L-4 L-5 L-6 L-7 L-8 L-9 溶CaCO3圈直径∕mm 1.5 1.8 2.5 1.7 2.8 2.9 3.5 3.3 1.8 产酸量∕﹪ 1.2 1.5 1.8 1.4 1.9 2.0 2.7 2.4 1.5
由表3-1结果可知，各菌株的溶CaCO3圈的大小与产酸量的多少呈正相关；在L-1～L-9各菌株中，以L-7菌株的溶CaCO3圈直径最大，达3.5mm，产酸量也最多，达2.7％，其次为L-8菌株，溶CaCO3圈直径为3.3mm，产酸量为2.4％，再次为L-6菌株，溶CaCO3
圈直径为2.9mm，产酸量为2.0％。L-5虽产酸量也达2.0％，但其溶CaCO3圈直径不如前
三者，因此，以L-7、L-8和L-6作为优选出的3个高产酸菌株。
