1,4-二巯基苏糖醇对溶菌酶淀粉样纤维化的抑制作用

第２５卷第５期　２０１３年５月　化学研究与应用　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｖｏ１．２５，Ｎｏ．５　Ｍａｙ，２０１３　

文章编号：１００４—１６５６（２０１３）０５－０６６５－０５　

１，４一二巯基苏糖醇对溶菌酶淀粉样纤维化的抑制作用　

李　杰，曾成鸣　

（陕西师范大学化学化工学院，陕西西安７１００６２）　

摘要：蛋白质淀粉样纤维化是很多人类疾病的重要特征，筛选蛋白质淀粉样纤维化的抑制剂对于研究和开发　相关疾病的治疗药物具有重要意义。本文采用溶菌酶作为模型，探索巯基化合物１，４－二巯基苏糖醇（Ｄ１Ｔｒ）对　蛋白质淀粉样纤维化的抑制作用。结果表明，ＤＩＴ对溶菌酶淀粉样纤维化具有较强的抑制作用，其／Ｃ５。数值　为１７￣，ｍｏｌ・Ｌ一。Ｄｒ丌抑制溶菌酶纤维化的作用与其巯基结构有关。在溶菌酶分子高级结构改变产生聚集　和纤维化的过程中，ＤＩＴ分子的巯基通过与溶菌酶的二硫键作用改变了多肽的构象，从而改变了溶菌酶纤维　

化的进程。　关键词：溶菌酶；淀粉样纤维化；１，４－二巯基苏糖醇；谷胱甘肽；半胱氨酸；二硫键　中图分类号：Ｑ５１８．４　文献标志码：Ａ　

Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　１，４－ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ　ｏｎ　ａｍｙｌｏｉｄ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ　

Ｕ　Ｊｉｅ．ＺＥＮＧ　Ｃｈｅｎｇ—ｍｉｎｇ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１００６２，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍａｎｙ　ｈｕｍａｎ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｂｙ　ａｍｙｌｏｉｄ　ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｔｏ　ｓｃｒ￣￣ｎ　ｉｎｈｉｂｉ－　ｔｏｒｓ　ｔｏ　ｉｎｔｅｒｒｕｐｔ　ｔｈｅ　ａｍｙｌｏｉｄ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｆｏｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ａｎｔｉ—ａｍｙｌｏｉｄ　ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．Ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　１，４－ｄｉｔｈｉｏ－　ｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＹｒ）ｏｎ　ａｍｙｌｏｉｄ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ　ａｓ　ａ　ｍｏｄｅｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　Ｉ邢ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ　ｆｉｂｒｉｌ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａｌｌ　ＩＣ５０ｖａｌｕｅ　ｏｆ　１７　ｐ，ｍｏｌ・Ｌ一　．Ｔｈｅ　ｔｈｉｏｌ—ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｗａｓ　ａ　ｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ—ａｍｙ—　ｌｏｉｄ　ｐｒｏｐｅ￣ｙ　ｏｆ　ＤｒＩＴ．Ｔｈｉｏｌ－ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ＷａＳ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｄｑ３７　ｏｎ　ａｍｙｌｏｉｄ　ｆｏｒｍａ－　ｔｉｏｒＬ　Ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｆｏｒｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｃｈａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｈｅｒｅｄ　ｕｐｏｎ　Ｄｑ３＇ｂｒｅａｋｉｎｇ－ｄｏｗｎ　ｔｈｅ　ｉｎｔｒａｍｏｌｅｅｕｌａｒ　ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｂｏｎｄｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ　ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌｙｓｏｚｙｍｅ；ａｍｙｌｏｉｄ　ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ；１，４－ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ；ｃｙｓｔｅｉｎｅ；ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｂｏｎｄ．　

蛋白质在一定的条件下可发生淀粉样变性而　形成纤维。这些淀粉样纤维沉积于细胞膜，造成　细胞损害或者诱导细胞凋亡＿１．２　Ｊ。多种人类疾病　

与蛋白或者多肽淀粉样纤维化有关，如Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ　疾病，疯牛病，帕金森氏病及ＩＩ型糖尿病等。虽然　与这些疾病相关的蛋白或者多肽序列上没有同源　性，高级结构各不相同，但是它们经聚集形成的淀　

粉样纤维在形态上十分相似，富含口一折叠结构，具　有较强的表面疏水性，对氧化还原环境更为敏感　等等，这些性质与淀粉样纤维的细胞毒性密切相　

关　。　

溶菌酶是一种具有抗菌作用的小分子蛋白，　其突变体可引起家族性淀粉样变性疾病，是最具　有淀粉样纤维化倾向的蛋白质之一【５　Ｊ。溶菌酶蛋　

白家族具有高度的序列和结构保守性。作为该超　

家族的成员，鸡卵清溶菌酶蛋白同样具有淀粉样　

收稿日期：２０１２－１０－２２：修回日期：２０１２．１２．１８　联系人简介：曾成鸣（１９５７一），男，教授，主要从事化学生物学研究。Ｅ－ｍａｉ

ｌ：ｃｈｅｎｇｍｉｎｇｚｅｎｇ＠ｓｎｎｕ．ｅｄｕ，ｃｎ　化学研究与应用　第２５卷　

纤维化倾向　』。我们先前的研究发现　，溶菌酶　

在淀粉样纤维化过程中，其二硫键外露增加，这些　

二硫键及其可能产生的自由巯基可诱导细胞膜骨　

架蛋白交联而损害细胞。巯基化合物有可能影响　

溶菌酶在淀粉样纤维化过程中的构象变化，进而　

改变纤维化的进程。本文以鸡卵清溶菌酶作为模　

型，探索巯基化合物１，４一二巯基苏糖醇（ＤＴＴ）对　

蛋白质淀粉样纤维化的抑制作用。这对于筛选蛋　

白质淀粉样纤维化的抑制剂和研发相关疾病的治　

疗药物具有重要意义。　

１　试验部分　

１．１材料与仪器　，　实验药品及试剂：鸡卵清溶菌酶，硫黄素（ｔｈｉｏｆｌａ－　

ｖｉｎ　Ｔ，ＴｈＴ），８．苯胺．１一萘磺酸（８咀ｎｉｌｉｎｏｎａｐｈｔｈａＩｅｎｅ一　

１一ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，ＡＮＳ），１，４一二巯基苏糖醇（１，４一ｄｉ—　

ｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，ＤＴＹ），苏糖醇，谷胱甘肽，半胱氨酸和　

氧化谷胱甘肽购自美国Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ公司；其他　试剂均为国产分析纯试剂。　

实验仪器：ＬＳ－５５型荧光分光光度计（美国　

Ｐｅｒｋｉｎ—Ｅｌｍｅｒ公司）；Ｈ－６００透射电镜（Ｈｉｔａｃｈｉ，１３　

本）。　

１．２样品制备　

溶菌酶淀粉样纤维：１００　ｍｇ鸡卵清溶菌酶蛋　

白溶于１０　ｍＬ　ＨＣ１（１０　ｍｍｏｌ・Ｌ～，ｐＨ　２．０）溶液，　

终浓度为１％（ｗ／ｖ）。混合液在水浴６５℃中孵育　１５天　］。纤维的生长曲线由ＴｈＴ荧光检测。成　

熟纤维保存在４￣Ｃ备用。　

１．３　ＴｈＴ荧光检测　

用１０　ｍｍｏ］・Ｌ　磷酸盐缓冲液（ＰＨ　７．０）配制　

ＴｈＴ溶液（１　ｍｍｏ／・Ｌ　），于４℃避光保存备用。　

取１０　孵育的溶菌酶样品，加至１０　ｍｍｏｌ・Ｌ　

Ｔｒｉｓ—ＨＣ１溶液（ｐＨ　８．０）中，再加入３０　ＩｘＬ　ＴｈＴ溶液　

使ＴｈＴ的终浓度为１０　Ｉｘｍｏｌ・Ｌ～，振荡１０　ｓ左右，　

用荧光分光光度计记录荧光强度。激发波长：４４０　

ａｍ，发射波长４８４　ｎｍ。　

１．４　ＡＮＳ荧光检测　配制１　ｍｍｏ｜・Ｌ一的ＡＮＳ溶液，在溶菌酶纤维　

样品中加入一定量的ＡＮＳ溶液使ＡＮＳ与蛋白质　

的浓度比值为１７：１。用荧光分光光度计检测ＡＮＳ　

与蛋白结合后的４００～６００　ｌｑｍ范围的荧光变化，　

准确记录最大发射波长及其相应荧光强度数值。　激发波长３７０　Ｆｉｎ。　１．５透射电子显微镜　

成熟溶菌酶纤维（浓度为１０　ｍｇ・ｍＬ　）用水　稀释，使其终浓度为０．５　ｍｇ・ｍＬ～，取１５　滴于　镀膜铜网上，１０　ｍｉｎ后用滤纸沿边缘吸干，滴加１５　

醋酸铀（２％）染色１０　ｒａｉｎ。透射电镜下观察纤　

维形态并拍照（电压８０　ＫＶ）。　

２结果与讨论　

２．１　Ｄ３３＇对溶菌酶淀粉样纤维化的抑制作用　ｒ】１ｈＴ是一种阳离子荧光试剂，能与淀粉样纤维　的　片层结构特异性结合，在４４０ｎｍ波长激发条　件下产生４８２ｎｍ的特征荧光发射峰。在６５ｏＣ，ｐＨ　

２．０的条件下，鸡卵清溶菌酶（１０　ｍｇ・ｍＬ　）经孵　育１２天左右可形成成熟的淀粉样纤维。由溶菌　酶单体到淀粉样纤维的过程伴随着蛋白分子的二　

级结构向　折叠转变，表现为ＴｈＴ荧光增强，如图　

１所示。溶菌酶纤维的生长过程以Ｓ型曲线为特　征，Ｓ型曲线表明蛋白质淀粉样纤维化是一个成　

核一聚合的动力学过程¨　。在纤维开始生长以前　的一定时间内，ＴｈＴ荧光较弱，此阶段被称为蛋白　质淀粉样纤维化过程中的延迟期（１ａｇ　ｐｈａｓｅ）。之　

后出现ＴｈＴ荧光突然增强的现象，直到荧光值达　

到一个相对稳定阶段，分别为为纤维的生长期和　

成熟期。　在上述体系中加入ＤＴＩ＇，溶菌酶的淀粉样纤　

维化受到抑制（图１），当ＤＴＹ的浓度达到１００　

￣ｘｍｏｌ・Ｌ　时，纤维化过程几乎被完全抑制，孵育　１２天的溶菌酶的ＴｈＴ荧光仍然没有明显升高。　

ＤｒｌＴ对溶菌酶纤维化的抑制作用与浓度呈正相　关，较低浓度的ＤＴＦ可延缓溶菌酶的纤维化，包括　增加延迟期时间和降低纤维的生长速度。从相关　数据推算出ＤＴＴ抑制溶菌酶纤维化的，ｃ　。数值为　

１７　ｍｏｌ　

图１　Ｄ１丫ｒ对溶茵酶淀粉样纤维化的抑制作用　Ｆｉｇ．１　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　１．４－ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ　Ｏｎ　ａｍｙｌｏｉｄ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌ

ｙｓｏｚｙｍｅ　６６８　化学研究与应用　第２５卷　

图４　ＤＴｒ对溶菌酶纤维化不同时期的影响　Ｆｉｇ．４　Ａｍｙｌｏｉｄ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｄ＂ＩＴ　ａｄｄｅｄ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　（在溶茵酶孵育过程的Ｏ（０）、３（★）、５（△）、７（▲）和　９（口）天加入１００　ｍｏ１・Ｌ　Ｄ１Ｔｒ的纤维生长曲线；　（●）为在整个溶茵酶孵育过程中不加ＤＴＩ＂的对照样品）　

２．５　Ｄｒｒｒ抑制溶菌酶纤维化与其巯基结构有关　ＤＴＩ＂是苏糖醇的１，２位羟基被巯基取代的化　

合物。与ＤＴＴ相比较，１００　Ｉ．Ｌｍｏｌ・Ｌ　的苏糖醇对　

溶菌酶淀粉样纤维化无抑制作用，说明Ｄ１ＴＩ１对溶　

菌酶纤维化的抑制作用与其巯基结构有关。另　

外，氧化型的ＤＴＩ＇（ＤＴＩ？形成分子内二硫键）也对　

溶菌酶淀粉样纤维化无抑制作用，证实巯基是　

Ｄｒｒｒ抑制溶菌酶纤维化的关键结构因素。谷胱甘　

肽和半胱氨酸分子中含有一个巯基，这些化合物　都对溶菌酶纤维化具有一定的抑制作用，其，ｃ　。数　

值分别为３９　ｍ０１．Ｌ　和５１　ｇｍｏｌ・Ｌ一，远低于　

Ｄ＇ＩＴ的抑制作用（１７　ｍｏｌ・Ｌ　）。同样，氧化型　

的谷胱甘肽对溶菌酶淀粉样纤维化无抑制作用。　

这些事实进一步证实ＤＴ？抑制溶菌酶纤维化的作　

用与其巯基结构密切相关，并且巯基化合物分子　

中的巯基数量决定了其抑制蛋白质淀粉样纤维化　

作用的效率。　需要说明的是，本文所采用的几种巯基化合　

物，ＤＴＦ、谷胱甘肽、半胱氨酸、以及其他对照化合　

物，在所测试的浓度范围内（１０－１００　Ｉｘｍｏｌ・Ｌ　），　

对ＴｈＴ．和ＡＮＳ一溶菌酶纤维的特征荧光均无影响。　

溶菌酶含有１２９个氨基酸残基，有４个链内　

二硫键，整个单链分子主要以仅螺旋结构为主，以　

一种较为紧密的方式组成三维结构，具有较强的　稳定性。较高浓度的溶菌酶（＞５　ｍｇ・ｍＬ　）在高