利用粳稻基因组DNA和Cot-1 DNA探针对普通野生稻和亚洲栽培稻的比较分析

长雄野生稻地下茎及耐冷性状功能基因组学及比较转录组学分析一、概述长雄野生稻，作为稻属的重要成员，其独特的地下茎无性繁殖特性及耐冷性状一直是科研人员关注的焦点。

地下茎作为多年生性的理想供体，不仅为水稻的遗传改良提供了宝贵的遗传资源，同时也为多年生稻的培育开辟了新的途径。

另一方面，长雄野生稻对低温等非生物胁迫的抗性，为培育抗逆水稻新品种提供了重要的基因资源。

功能基因组学和比较转录组学作为现代生物学的重要研究手段，为我们深入解析长雄野生稻地下茎及耐冷性状的分子机制提供了有力工具。

通过构建地下茎茎尖的均一化cDNA文库，并进行测序分析，我们可以获得大量与地下茎发育相关的功能候选基因。

同时，利用基因芯片及转录组测序等技术平台，我们可以对地下茎发育及耐冷性进行系统的比较转录组学分析，从而揭示水稻耐冷胁迫调控的分子遗传机制。

本研究旨在通过功能基因组学和比较转录组学的分析方法，全面解析长雄野生稻地下茎及耐冷性状的遗传基础与分子机制。

我们期望通过这项研究，不仅能够为水稻的遗传改良和抗逆育种提供新的策略和思路，同时也能够为理解禾本科植物的进化与多年生性提供重要的理论依据。

1. 野生稻资源的重要性及长雄野生稻的特点野生稻作为水稻的近缘野生种，拥有着丰富的遗传变异和优异的农艺性状，对于现代农业中的遗传育种和资源保护具有不可替代的重要性。

它们不仅为栽培稻的遗传改良提供了宝贵的基因库，还为我们理解水稻的生物学特性、适应机制和进化历程提供了重要的线索。

在众多野生稻种中，长雄野生稻（Oryza longistaminata）以其独特的生物学特性和遗传资源而备受关注。

长雄野生稻起源于非洲，具有与亚洲栽培稻相同的AA基因组，这使得它们之间的基因交流和遗传改良成为可能。

长雄野生稻还展现出多种优良的农艺性状，如地下茎无性繁殖、对低温等非生物胁迫的抗性，以及对白叶枯病和稻瘟病等病害的抗性，这些都为通过遗传工程手段培育抗逆、高产的水稻新品种提供了丰富的基因资源。

野生稻与栽培稻之间的遗传分化
森岛启子;王象坤
【期刊名称】《农业考古》
【年(卷),期】1998()1
【摘要】野生稻与栽培稻之间的遗传分化日本国立遗传研究所森岛启子，王象坤译一、栽培稻──野生稻复合体的分类现状稻属有两个栽培种和大约２０个野生种（Ｖａｕｅｈａｎ，１９８９）。

全世界普遍栽培的普通稻是亚洲栽培稻（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ），而另一个栽培稻是局限于西...
【总页数】7页(P30-35)
【关键词】野生稻;栽培稻;非随机组合;同工酶;基因库;普通野生稻;普通栽培稻;亚洲栽培稻;遗传分化;数量性状
【作者】森岛启子;王象坤
【作者单位】日本国立遗传研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S511.9
【相关文献】
1.普通野生稻和亚洲栽培稻叶绿体DNA的籼粳分化 [J], 孙传清;吉村淳
2.野生稻与栽培稻之间第6染色体的遗传比较 [J], Sano,Y;徐宗俦
3.杂草稻、栽培稻及野生稻的遗传多样性比较 [J], 王黎明;李战胜;高旭华;沈雪峰;方越;陈勇
4.从普通野生稻DNA的籼粳分化看亚洲栽培稻的起源与演化 [J], 孙传清;王象坤;李自超
5.一个AA基因组特异的串联重复序列的克隆及其在中国普通野生稻和栽培稻中的分化特征 [J], 王振山;陈浩;李小兵;梁承志;王象坤;朱立煌
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普通栽培稻遗传改良现状及其发展趋势
陆峰;赵伟;黄群策;张博
【期刊名称】《农业科技通讯》
【年(卷),期】2023()2
【摘要】概述了我国第一代杂交水稻育种的艰难探索历程及其主要研究成果,对第一代杂交水稻育种的技术特点进行了评述。

袁隆平先生的研究成果主要体现在3个方面,即正式揭开了利用水稻杂种优势的实际性技术探索的研究序幕并建立了杂交水稻育种学科、在全球范围大力推广应用杂交水稻育种成果并产生巨大的社会效益和经济效益、建立了普通栽培稻杂种优势利用的学科框架并指明了其未来的发展方向。

在染色体组多倍化水平上寻找新的技术突破口是稻属植物遗传改良的重要发展方向。

【总页数】4页(P4-6)
【作者】陆峰;赵伟;黄群策;张博
【作者单位】桂林市农业生态与资源保护站;广西智友生物科技股份有限公司;郑州大学离子束生物工程重点实验室;广西星火原生物科技有限责任公司
【正文语种】中文
【中图分类】S51
【相关文献】
1.用SSR标记比较亚洲栽培稻与普通野生稻的遗传多样性
2.普通野生稻和亚洲栽培稻核心种质遗传多样性的检测研究
3.栽培稻与普通野稻杂交杂种优势和农艺性
状的遗传分析4.转Cry1Ac/CpTI栽培稻外源基因渗入普通野生稻中可稳定的遗传和表达5.普通野生稻(Oryza rufipogon)DNA导入栽培稻后代主要性状的遗传变异
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中国普通野生稻遗传多样性研究进展杨庆文;黄娟【期刊名称】《作物学报》【年(卷),期】2013(039)004【摘要】普通野生稻是亚洲栽培稻的祖先,中国作为亚洲栽培稻的起源地之一,蕴藏着丰富的普通野生稻资源.为了揭示中国普通野生稻的遗传多样性分布状况,探索普通野生稻的遗传变异规律、居群遗传结构以及演化途径等,为亚洲栽培稻的起源进化研究、品种改良和普通野生稻保护提供科学依据,国内外学者对中国普通野生稻开展了大量的遗传多样性研究,获得了丰富的研究结果.本文分别从遗传多样性研究方法、普通野生稻与亚洲栽培稻遗传多样性的比较、普通野生稻遗传多样性与地理分布和生态环境的关系、保护措施和栽培稻基因渗入对遗传多样性的影响等几个方面的研究结果进行了综述,总结了中国普通野生稻遗传多样性的主要特征,提出了未来我国普通野生稻遗传多样性的研究方向.%Common wild rice (Oryza rufipogon Griff.) is recognized to be the ancestor of Asian cultivated rice (Oryza sativa L.).As one of the origins of Asian cultivated rice,China is rich of genetic resources of common wild rice.In order to provide scientific bases for studies on the origin,evolution and variety improvement of Asian cultivated rice as well as the conservation of common wild rice,a lot of studies on genetic diversity of common wild rice in China have been carried out to reveal the distribution of genetic diversity,population structure and evolutionary way of common wild rice for the last decades.This paper introduced the research methods and the applicationhistory of markers used in genetic diversity studies of common wild rice,systematically summarized the main characteristics of genetic diversity of common wild rice in China in several aspects including the abundance of genetic diversity of common wild rice,comparison of genetic diversity between common wild rice and Asian cultivated rice,the influence of geographic conditions and environments as well as gene flow from cultivated rice to the common wild rice.Based on the analyses of present studies,the authors provided their own opinion about the key points in the future research on genetic diversity of common wild rice in China.【总页数】9页(P580-588)【作者】杨庆文;黄娟【作者单位】中国农业科学院作物科学研究所,北京100081;中国农业科学院作物科学研究所,北京100081;广西壮族自治区农业科学院水稻研究所,广西南宁530007【正文语种】中文【相关文献】1.中国与东南亚三国(越、老、柬)普通野生稻遗传多样性的比较研究 [J], 孙希平;杨庆文2.中国普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)原生境保护与未保护居群的遗传多样性比较 [J], 王家祥;陈友桃;黄娟;乔卫华;张万霞;杨庆文3.中国不同牛种DGAT1基因遗传多样性及经济性状关联分析研究进展 [J], 王思伟;王学清;王昆4.中国油豆角种质资源遗传多样性的研究进展 [J], 肖靖; 管洪波; 陈树良; 王喜山;鄂成林; 石晓华5.中国普通野生稻的原地保护及其遗传多样性研究进展 [J], 李小湘;段永红;王淑红;刘勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

水稻Pib基因及其连锁RFLP标记在栽培稻、药用野生稻和玉
米中的比较物理
水稻Pib基因及其连锁RFLP标记在栽培稻、药用野生稻和玉米中的比较物理定位
比较遗传学研究表明,禾本科不同基因组之间存在着广泛的同线性和共线性.对水稻(Oryza sativa L.)这一模式植物与其他禾本科植物的原位杂交定位可以揭示禾本科植物基因组的共同特点和进化规律,为建立禾本科遗传大体系积累资料.实验以图位克隆法分离的水稻Pib 基因(10.3 kb)和与之连锁的RFLP标记为探针, 研究了Pib及与其连锁的RFLP标记在供试种中的同源性和物理位置. Southern杂交结果表明,Pib在玉米(Zea mays L.)基因组中有同源序列.进一步利用单色和双色荧光原位杂交技术确定了Pib在栽培稻(O.sativa ssp. indica cv. Guangluai 4)、玉米和药用野生稻(O. officinalis Wall ex Watt)染色体上的物理位置.定位结果表明,Pib基因和与之连锁的RFLP标记在这3个供试种基因组中具有同线性.
作者：李霞宁顺斌金危危宋运淳作者单位：武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室,武汉,430072 刊名：植物学报 ISTIC SCI英文刊名：ACTA BOTANICA SINICA 年，卷(期)：2002 44(1) 分类号：Q943 关键词：水稻 RFLP标记双色荧光原位杂交 Pib 比较物理定位 rice RFLP markers double-color FISH ?Pib? comparative physical mapping。

药用野生稻基因组ＤＮＡ提取方法比较毕继安１，王芳１，张国芳１，朱宏芬１，沈岚１，郑红英２，严成其１∗㊀（１．宁波市农业科学研究院生物技术研究所，浙江宁波３１５１０１；２．宁波大学植物病毒学研究所，浙江宁波３１５２０１）摘要㊀以药用野生稻为试验材料，分别选用传统的ＣＴＡＢ提取法㊁ＣＴＡＢ改良方法㊁碱裂解法㊁磁珠法㊁吸附柱法㊁尿素提取法及酶消化法７种方法提取水稻叶片组织ＤＮＡ，７种方法分别标记为Ａ Ｇ㊂通过比较这些方法提取出ＤＮＡ的浓度和纯度，分析这些方法的优劣势㊂７种方法均能获得较好的基因组，按获得ＤＮＡ浓度表现为Ａ＞Ｂ＞Ｆ＞Ｃ＞Ｇ＞Ｅ＞Ｄ，纯度表现为Ｄ＞Ｅ＞Ｃ＞Ｇ＞Ｂ＞Ｆ＞Ａ㊂综合考量ＤＮＡ的纯度㊁浓度㊁提取时间㊁成本㊁安全无毒等方面因素，若对基因组的质量要求不高，只是做简单的检测且考虑成本问题，可以选择ＣＴＡＢ提取法㊁ＣＴＡＢ改良方法和尿素提取法；若需要高纯度基因组，可以选择磁珠法㊁吸附柱法㊁碱裂解法；若考虑安全无毒㊁快速提取及成本可控，可以选择磁珠法㊁吸附柱法；若样品稀有，可以选用ＣＴＡＢ提取法和ＣＴＡＢ改良法㊂关键词㊀药用野生稻；叶片；基因组；提取方法；有利基因中图分类号㊀Ｓ５１１㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀０５１７－６６１１（２０２３）１４－００８６－０４ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２３．１４．０２１㊀㊀㊀㊀㊀开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓｏｆＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍＯｒｙｚａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓＢＩＪｉ⁃ａｎ，ＷＡＮＧＦａｎｇ，ＺＨＡＮＧＧｕｏ⁃ｆａｎｇｅｔａｌ㊀（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮｉｎｇｂｏＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｎｉｎｇｂｏ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ３１５１０１）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＷｉｔｈＯｒｙｚａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓａｓｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌ，ｓｅｖｅｎｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍｔｈｅＯｒｙｚａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ，ｉｍｐｒｏｖｅｄＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ，ａｌｋａｌｉｎｅｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄ，ｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｍｅｔｈｏｄ，ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎｍｅｔｈｏｄ，ｕｒｅａｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅｓｅｖｅｎｍｅｔｈｏｄｓａｒｅｌａｂｅｌｅｄＡ－Ｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＢｙｃｏｍｐａｒｉｎｇｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｔｙｏｆＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．ＡｌｌｓｅｖｅｎｍｅｔｈｏｄｓｃａｎｏｂｔａｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ．ＴｈｅｏｒｄｅｒｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｈｉｇｈｔｏｌｏｗｉｓＡ＞Ｂ＞Ｆ＞Ｃ＞Ｇ＞Ｅ＞Ｄ，ａｎｄｔｈｅｏｒｄｅｒｏｆｐｕｒｉｔｙｆｒｏｍｈｉｇｈｔｏｌｏｗｉｓＤ＞Ｅ＞Ｃ＞Ｇ＞Ｂ＞Ｆ＞Ａ．Ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇｔｈｅｐｕｒｉｔｙ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ，ｃｏｓｔ，ｓａｆｅｔｙａｎｄｎｏｎ⁃ｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ，ＣＴＡＢｏｒＣＴＡＢｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｕｒｅａｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｍａｙｂｅｐｒｅｆｅｒｒｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｃｏｓｔａｎｄｐｕｒｉｔｙ．Ｔｈｅｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄ，ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎａｎｄａｌｋａｌｉｎｅｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｉｓｐｒｅｆｅｒｒｅｄｗｈｅｎｈｉｇｈ⁃ｐｕｒｉｔｙａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄ．Ｔｈｅｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄａｎｄａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎｍｅｔｈｏｄｉｓｐｒｅｆｅｒｒｅｄｗｈｅｎｓａｆｅｔｙ，ｎｏｎ⁃ｔｏｘｉｃｉｔｙ，ｒａｐｉｄｅｘｔｒａｃ⁃ｔｉｏｎａｎｄｃｏｓｔｌｉｔｔｌｅａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄ，ｗｈｉｌｅｔｈｅＣＴＡＢａｎｄＣＴＡＢｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｉｓｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄｆｏｒｌｉｍｉｔｅｄｓａｍｐｌｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｏｒｙｚａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ；Ｌｅａｆ；Ｇｅｎｏｍｅ；Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；Ｆａｖｏｒａｂｌｅｇｅｎｅｓ基金项目㊀宁波市农业科学研究院院长基金项目（２０２２ＮＫＹＰ００５）；宁波市科技创新２０２５重大专项（２０２１Ｚ１０６）；宁波市科技创新２０２５重大专项（２０１９Ｂ１０００４）㊂作者简介㊀毕继安（１９８７ ），男，山东青岛人，博士，从事抗病育种研究㊂∗通信作者，研究员，博士，从事抗病育种研究㊂收稿日期㊀２０２２－０８－０８㊀㊀药用野生稻多生长于海拔６００ １１００ｍ丘陵山坡中下部的冲积地和沟边，为喜暖㊁喜雨㊁喜潮湿的短日照植物，适宜在阴蔽㊁腐殖质丰富㊁ｐＨ为６左右的肥沃砂壤土上生长㊂药用野生稻在稻属２２个种中长势最强，是普通栽培稻的２０倍以上，在进化过程中，药用野生稻形成了丰富的遗传多样性，药用野生稻因长期处于野生环境，经受各种自然灾害和地理生态因素的考验，形成了较强的抗性和耐受不良环境因素等方面的优异性状，是天然的基因库㊂药用野生稻农艺性状具有大穗㊁宽叶片㊁粗茎秆等性状，为遗传改良提供了良好的资源条件㊂因此，深入挖掘药用野生稻的优良基因对于新种质创新具有重要意义㊂①大量的抗病基因㊂有研究人员通过对抗病基因的克隆以及高抗条纹叶枯病水稻材料的获得，使药用野生稻资源得到了充分利用，更进一步推动了药用野生稻抗病基因的开发与研究［１］㊂水稻白叶枯病是水稻生长发育过程中常见的病害，而药用野生稻具有大量的优异抗性基因，因此从药用野生稻中挖掘抗白叶枯病基因并加以利用，得到了广大科研工作者的高度重视㊂研究发现，云南药用野生稻多个居群类型对４种主要病害存在一定抗性［２－３］，云南药用野生稻种质资源对当地一定时期流行的白叶枯病小种及国内外部分强致病菌整体抗性较好［４］，这些研究为药用野生稻的有效抗病基因挖掘奠定了基础㊂②创制新种质资源㊂研究发现，利用构建药用野生稻ＴＡＣ文库筛选有利基因并通过克隆㊁遗传转化方法及结合育种技术，有望实现药用野生稻在新种质资源上的创制［５－７］㊂同时，栽培稻与药用野生稻种间杂种体内异源基因组重组引起的ＤＮＡ甲基化变异规律为不对称体细胞杂交的基因融合奠定了基础［８］，有研究发现，将药用野生稻总ＤＮＡ通过穗茎注射法导入恢复系Ｒ２２５可以创制耐阴㊁耐光氧化的水稻新种质［９］㊂③优异内源基因的挖掘㊂有研究表明，云南药用野生稻净光合速率较高，其在羧化效率和光饱和点上所表现出的高光效潜能为探索机体高光效基因提供了理论依据［１０－１１］㊂药用野生稻中淀粉合成酶基因在同属内的自然进化规律的探索，也为水稻的遗传育种和品质改良提供科学依据［１２－１３］㊂④抗逆途径基因挖掘㊂有研究人员通过基于药用野生稻干旱胁迫转录组数据分析探索ＡＤＦ基因对药用野生稻非生物胁迫的影响［１４］，同时还有研究表明，药用野生稻中ＬＥＡ蛋白在植物抗逆反应起着重要的作用，这为水稻遗传改良提供重要的理论依据［１１，１５］㊂上述研究说明药用野生稻中药用野生稻中存在大量㊁有利㊁可挖掘的基因，是种质创新的有利基因库，而组织样品的提取方法还不够完善与全面，这将会导致存在部分有利基因片段获取不够完整，因此选择一种合适的方法提取药用野生稻基因组ＤＮＡ对于有利基因的深入挖掘至关重㊀㊀㊀安徽农业科学，Ｊ．ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．２０２３，５１（１４）：８６－８９要㊂药用野生稻因其生理结构特征比栽培稻较为复杂，其基因组提取相对困难，提取质量相对偏低，因此对药用野生稻ＤＮＡ提取方法进行探索，优化提取步骤，为获得更加合适㊁更加完整的基因组结构提供理论依据㊂笔者以药用野生稻为素材，综合采用７种方法来提取植物的基因组，比较各种方法所提取的基因组含量与纯度，旨在为后序深入挖掘药用野生稻的有利基因提供技术依据㊂１㊀材料与方法１．１㊀试验材料㊀药用野生稻为该试验培育，准备药用野生稻相同叶位的７组样品，每组样品准确称取０．６ｇ，然后三等分㊂主要试剂：聚乙烯吡咯烷酮（生工生物工程（上海）股份有限公司，中国），β－巯基乙醇（索莱宝生物科技有限公司，中国），ＰｒｏｔｅｉｎＫ（索莱宝生物科技有限公司，中国），磁珠（美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司，ＵＳ），ＤＮＡ提取试剂盒（ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ），Ｒ－淀粉酶（美国Ｓｉｇｍａ公司，ＵＳ）㊂主要仪器：组织研磨仪（Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ－９６，上海净信实业发展有限公司），离心机（５４２４Ｒ，德国艾本德股份公司），恒温水浴锅（ＤＫ－８Ｄ，上海一恒科学仪器有限公司），超微量紫外分光光度计（ＮａｎｏＤｒｏｐＯｎｅＣ，ＵＳ）㊂１．２㊀试验方法１．２．１㊀基于ＣＴＡＢ的经典ＤＮＡ提取方法㊂①取０．２ｇ水稻叶片组织于液氮中研磨成细粉状，并将粉末快速转移到２ｍＬ离心管中㊂②加入５００μＬ提取缓冲液［２％ＣＴＡＢ，１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４），５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），１．４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，０．２％β－巯基乙醇］，颠倒混合均匀离心管，将混合物置于６５ħ水浴中孵育３０ｍｉｎ，每隔１０ｍｉｎ颠倒混匀一次㊂③将离心管置于离心机中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ㊂转移离心管中上层液体到新的１．５ｍＬ离心管中㊂④加入２００μＬ苯酚ʒ氯仿ʒ异戊醇（２５ʒ２４ʒ１）到离心管中并颠倒混合均匀，于室温静置５ｍｉｎ，将离心管置于离心机中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，转移离心管中上层液于新的１．５ｍＬ离心管中㊂⑤加入２００μＬ氯仿ʒ异戊醇（２４ʒ１）溶液轻轻颠倒混匀，于室温静置５ｍｉｎ后，将其置于离心机中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，转移离心管的上层液体到新的１．５ｍＬ离心管中㊂⑥加入２倍体积的冷乙醇（预先于－２０ħ保存），轻混匀，并转移到－２０ħ冰箱中静置３０ｍｉｎ㊂⑦将离心管置于离心机中，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，弃上清㊂⑧加入洗涤缓冲液（７０％乙醇，１０ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸铵），重悬沉淀，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，弃上清㊂重复该操作步骤一次㊂⑨将沉淀置于空气中干燥并用１００μＬ超纯水将其溶解，并将其置于３７ħ水浴锅中孵育３０ｍｉｎ㊂最后将其置于－２０ħ冰箱中备用或用于后续试验［１６－１７］㊂１．２．２㊀基于ＣＴＡＢ提取ＤＮＡ方法的改良㊂①取０．２ｇ水稻叶片和０．１ｇ聚乙烯吡咯烷酮于液氮中研磨成粉末㊂②将粉末转移至２ｍＬ离心管中㊂随后将１ｍＬ预冷提取缓冲液（１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ㊁５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ㊁５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ和２％β－巯基乙醇，最终调节ｐＨ至８．０）加入离心管中，涡旋振荡混合物，并在室温下静置１０ｍｉｎ㊂然后将离心管于４ħ１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，弃上清㊂③将沉淀悬浮于１ｍＬ预热的提取缓冲液中（３％ＣＴＡＢ㊁１．４ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ㊁１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ㊁０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ和２％β－ＭＥ，ｐＨ为８ ０），与此同时加入２０μＬＰｒｏｔｅｉｎＫ并将混合物于６５ħ水浴下孵育至少１ｈ，同时每隔２０ｍｉｎ颠倒混匀一次，然后将混合物于４ħ１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ㊂④将上清液转移到新的２ｍＬ离心管中，然后向离心管中加入等体积的氯仿ʒ异戊醇（２４ʒ１）㊂颠倒混匀后置于室温下静置１０ｍｉｎ，然后于４ħ１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ㊂⑤将水相转移到新的２ｍＬ离心管中㊂加入大约１／１０体积的２．５ｍｏｌ／ＬＫＡＣ溶液（ｐＨ５．２）㊂⑥将上层水相转移到另一个新的２ｍＬ管中，加入１／３体积的冰异丙醇溶液㊂将离心管静置于－２０ħ冰箱中３０ｍｉｎ，随后在４ħ１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ㊂⑦弃上清，用多糖㊁多酚洗涤缓冲液（含５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ㊁５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ㊁３５０ｍｍｏｌ／Ｌ山梨糖醇，ｐＨ８．０）洗涤１次㊂⑧弃掉上清液，将含有ＤＮＡ的白色沉淀用７０％乙醇洗涤２次，自然环境干燥㊂⑨将最终的ＤＮＡ沉淀用１００μＬ超纯水溶解［１８－１９］㊂１．２．３㊀碱裂解法㊂①取０．２ｇ水稻叶片组织于液氮中研磨成细粉状，接着将其转移到２ｍＬ离心管中㊂②在离心管中加入１００μＬ碱性裂解试剂［２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＯＨ和０．２ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ＰＨ８．０）］，随后添加１００μＬ缓冲试剂［４０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ５）］并混匀，静置２ｍｉｎ㊂③将离心管置于离心机中１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液㊂④上清液中加入２０μＬ蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ）及５μＬＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）后于３７ħ水浴锅中孵育３０ｍｉｎ，再将其置于６５ħ水浴锅孵育１０ｍｉｎ㊂⑤加入２００μＬ氯仿ʒ异戊醇（２４ʒ１）溶液并轻轻颠倒混匀，静置５ｍｉｎ后，将其置于离心机中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，转移离心管中的上层液体到新的１．５ｍＬ离心管中㊂⑥加入２倍体积的冷乙醇（预先于－２０ħ保存），轻混匀，并于－２０ħ冰箱中静置３０ｍｉｎ㊂⑦将离心管置于离心机中，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，弃上清㊂⑧加入７０％乙醇溶液重悬沉淀，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，弃上清；重复该操作步骤１次㊂⑨室温条件下晾干沉淀，加入１００μＬ超纯水充分溶解，保存于－２０ħ冰箱中待用［２０］㊂１．２．４㊀磁珠法㊂①取０．２ｇ水稻叶片组织于液氮中研磨成粉末，并将粉末转移到２ｍＬ离心管中，并加入１ｍＬ裂解缓冲液（２％ＣＴＡＢ㊁２．５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ㊁０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ㊁２０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ），颠倒混匀㊂②将上述混合物通过０．２２μｍ过滤器，转移到新２ｍＬ离心管中，在滤液中加入８００μＬ异丙醇和５０μＬ蛋白酶Ｋ，充分混匀㊂③在滤液中加入２０μＬ磁珠原液并涡旋３ ４ｍｉｎ，静置１ｍｉｎ㊂④将混合物置于磁力架沉淀磁珠，弃去上清中不含磁珠的液体㊂⑤磁珠用１ｍＬＣＷ１缓冲液（含７ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍的５０％异丙醇溶液）进行清洗㊂⑥磁珠再用１ｍＬＣＷ２缓冲液（７５％乙醇）洗涤２次㊂随后室温放置５ｍｉｎ以蒸发残留的乙醇㊂⑦将３０μＬ洗脱缓冲液（１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．５，预热至５５ħ）加入磁珠中，随后在５５ħ水浴锅中孵育５ｍｉｎ，孵育期间每隔１ｍｉｎ涡旋２０ｓ㊂⑧将混合物置于磁力架上，吸取上清液备用［２１－２３］㊂７８５１卷１４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀毕继安等㊀药用野生稻基因组ＤＮＡ提取方法比较１．２．５㊀吸附柱法㊂①取０．２ｇ水稻叶片组织置于研钵中，同时加入液氮充分研磨㊂②加入４４０μＬ缓冲液ＡＰ１，颠倒混匀材料，再加４μＬＲＮａｓｅ后，剧烈涡旋混匀㊂③将上述混合物在６５ħ下温浴１５ｍｉｎ，每隔５ｍｉｎ轻轻颠倒试管２ ３次㊂④加入１３０μＬ缓冲液ＡＰ２后，轻柔颠倒混匀，并将其置于冰上静置５ｍｉｎ㊂⑤将离心管置于离心机中，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，缓慢吸取上层液体（５００μＬ）置于ＭｉｎｉＳｐｉｎＣｏｌｕｍ（柱）中，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ㊂⑥将上一步中的滤液（４５０μＬ）缓慢转移至一新的离心管中，并在溶液中缓慢加入１．５倍体积（６７５μＬ）的缓冲液ＡＰ３㊂⑦将上一步中混合液（包括形成的沉淀）转移至ＭｉｎｉＳｐｉｎＣｏｌｕｍ（柱）中，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，丢弃废液㊂⑧在ＭｉｎｉＳｐｉｎＣｏｌｕｍ（柱）中加入５００μＬ缓冲液ＡＷ，放置３ ５ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，弃掉废液㊂重复洗涤１次㊂⑨在ＭｉｎｉＳｐｉｎＣｏｌｕｍ（柱）中加入５００μＬ无水乙醇，放置３ ５ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，丢弃废液和收集管㊂⑩在ＭｉｎｉＳｐｉｎＣｏｌｕｍ（柱）下置１．５ｍＬ离心管，吸取１００μＬ超纯水加到Ｄｎｅａｓｙ膜上㊂６５ħ水浴锅中静置５ｍｉｎ，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ得到ＤＮＡ㊂１．２．６㊀尿素提取法㊂①利用液氮将０．２ｇ水稻叶片组织研磨成粉末，并转移到２ｍＬ离心管中㊂②在离心管中加入６００μＬ尿素提取液（４２ｇ尿素㊁７ｍＬ５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ㊁５ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０㊁４ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡｐＨ８．０和５ｍＬ２０％Ｎａ－Ｎ－月桂酰肌氨酸，加入无菌蒸馏水调整最终体积至１００ｍＬ，温度不高于７０ħ）涡旋混匀，于室温下静置１ｈ㊂③将离心管置于离心机中，以１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ㊂④取上清，加入等体积的苯酚ʒ氯仿（１ʒ１）溶液，涡旋混匀离心管㊂⑤将离心管置于预冷的４ħ离心机中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ㊂⑥取上清液，加入等体积的异丙醇溶液，颠倒混匀，于４ħ环境静置１ｈ㊂⑦将离心管置于预冷的４ħ的离心机中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ㊂⑧弃上清，真空干燥沉淀２ｍｉｎ㊂⑨用１００μＬＴＥ缓冲液（１ｍＬ１．０ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ和０．２ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，调节ｐＨ到８．０，并用无菌水定容至１００ｍＬ）溶解沉淀，待用［２４－２５］㊂１．２．７㊀酶消化法㊂①取０．２ｇ水稻组织叶片在液氮中充分研磨后加入３００μＬ缓冲液［含０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）和０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ］，并涡旋振荡混匀㊂②在上述溶液中加入１０μＬＲ－淀粉酶（Ｓｉｇｍａ，ＵＳ），颠倒混匀，于８０ħ恒温金属浴中孵育１ｈ㊂③加入３３μＬ２％ＳＤＳ㊁２０μＬＰｒｏｔｅｉｎＫ和１μＬＲＮａｓｅＡ，并将其置于５５ħ恒温金属浴中孵育１ｈ㊂④加入３００μＬ苯酚ʒ氯仿ʒ异戊醇（２５ʒ２４ʒ１）溶液，剧烈涡旋振荡２ｍｉｎ㊂⑤将上述溶液于１５０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，转移上清溶液至２．０ｍＬ离心管中，随后加入２倍体积预冷乙醇并置于冰上静置１５ｍｉｎ㊂⑥将离心管置于预冷的离心机中，４ħ１５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，弃上清㊂⑦离心管中加入５００μＬ预冷的７０％乙醇，洗涤沉淀，４ħ，１５０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ㊂重复１遍㊂⑧弃上清，室温下风干沉淀，加入１００μＬ超纯水溶解沉淀，待用［２６－２８］㊂２㊀结果与分析２．１㊀水稻基因组浓度㊀采用７种方法得到水稻叶片的基因组后，利用超微量紫外分光光度计测量其浓度，具体数值见表１，不同提取方法得到的ＤＮＡ浓度存在差异，浓度由高到低依次为Ａ＞Ｂ＞Ｆ＞Ｃ＞Ｇ＞Ｅ＞Ｄ，通过ＣＴＡＢ法获得的基因组ＤＮＡ可能存在与植物组织中少量的糖类及淀粉或其他物质结合，因此在测量过程中存在一定偏差，导致浓度偏高；而通过磁珠法提取的基因组，因其是在外磁场的作用下纳米磁性微球与核酸结合，磁场大小及磁性微球的特性决定其结合能力，因此浓度偏低一些㊂２．２㊀水稻基因组纯度㊀核酸纯度一般用Ａ２６０／Ａ２３０和Ａ２６０／Ａ２８０来表示㊂其中，２６０ｎｍ是核酸最高吸收峰的吸收波长，２３０ｎｍ是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，２８０ｎｍ是蛋白最高吸收峰的吸收波长㊂高纯度的ＤＮＡ其Ａ２６０／Ａ２８０比值大于１．８，如果比值小于１．８，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要对样品进行纯化；同时ＤＮＡ纯度的另一个指标为Ａ２６０／Ａ２３０，如果Ａ２６０／Ａ２３０的比值大于１．８，说明纯度较高，如果小于１．８，表示样品被碳水化合物（糖类）㊁盐类或有机溶剂污染，需要对样品进行纯化㊂根据测定结果来看，这些方法提取的ＤＮＡ纯度均较高，纯度表现为Ｄ＞Ｅ＞Ｃ＞Ｇ＞Ｂ＞Ｆ＞Ａ（表１）㊂从纯度数据来看，利用磁珠法提取的基因组纯度最高㊂表１㊀不同提取方法的样品浓度及纯度比较Ｔａｂｌｅ１㊀Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｔｙｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃ⁃ｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓａｍｐｌｅ提取方法Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ样品平均浓度Ａｖｅｒａｇｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓａｍｐｌｅｓʊｎｇ／μＬＡ２６０／Ａ２３０Ａ２６０／Ａ２８０Ａ１８１６．２８６１．８５０１．８７８Ｂ１６０３．５７７１．９０５１．８９６Ｃ１５８５．３０２１．９８５１．９３６Ｄ１１３１．６６７２．０２３２．１３３Ｅ１２４９．０２４１．９７８２．００５Ｆ１５８７．４９９１．８７６１．８６８Ｇ１３２８．３６９１．９６１１．９０６３㊀讨论对以上７种方法提取的基因组ＤＮＡ浓度及纯度进行测定，发现经典ＣＴＡＢ提取方法提取的浓度及纯度较高，适合一般性试验需要，但在试验过程中会用到含有氯仿的有毒试剂，且耗时较长，这需要试验人员规范操作；基于ＣＴＡＢ的改良方法，提取过程中会使用蛋白酶Ｋ，这样会有效酶解与核酸结合的组蛋白，使ＤＮＡ游离在溶液中，且ＥＤＴＡ等螯合剂均不能使之失活，这样提取出的ＤＮＡ纯度会更高一些；利用碱裂解法提取的叶片组织效果和ＣＴＡＢ相差不大，在裂解植物组织方面效果较好，尤其是在提取纤维素较多的根部㊁茎部优势较为明显；磁珠法提取基因组ＤＮＡ在前期裂解上使用的是ＣＴＡＢ试剂，但是在纯化的过程中利用了磁珠的优势，使其能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合，并利用二氧化硅包被的纳米磁性微球的超顺磁性，在８８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年Ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ盐（盐酸胍㊁异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能从样本中分离出纯度较高的基因组ＤＮＡ，可用于后续分子杂交试验，但是价格较昂贵㊂吸附柱法是在离心吸附柱内使用一种硅基质滤膜，这种滤膜在低ｐＨ㊁高浓度盐存在的条件下，可以选择性吸附ＤＮＡ片段，而蛋白和其他杂质不会被吸附㊂通过这种方法提取出的ＤＮＡ浓度相对其他方法较低，有一定量的ＤＮＡ损失，但是纯度相对较高，减少了有毒试剂的使用，提取时间也相对较短；尿素提取法操作过程比较温和，不需要剧烈的振荡及高温的处理，不易造成ＤＮＡ变性降解；酶消化法提取的ＤＮＡ可以轻松地去除植物组织中的淀粉和糖原，用这种方法提取的ＤＮＡ能避免了基因组中淀粉及糖原的干扰，使ＤＮＡ的纯度会更高一些，利于基因组获取更加全面与完整㊂因此，需要根据试验材料㊁目的以及后续研究需要综合评估选用适宜的提取纯化方法，在得率与纯度间取得平衡㊂该研究比较了７种不同ＤＮＡ提取方法，为后续开展药用野生稻基因组的分离及其功能研究奠定基础㊂４　结论药用野生稻作为我国的主要野生稻物种，因其体内含有大量未知功能的有利基因，近些年得到了较为广泛的研究㊂笔者比较了不同提取野生稻基因组ＤＮＡ方法，综合各方面因素考量，若只需简单的检测且考虑成本问题，可以选择ＣＴＡＢ提取法㊁ＣＴＡＢ改良方法和尿素提取法，但在使用过程中会用到较毒的有机试剂，提取过程需小心谨慎；如需要高纯度基因组可以选择磁珠法㊁吸附柱法㊁碱裂解法；若考虑安全无毒㊁快速提取及成本可控可以选磁珠法㊁吸附柱法；若样品稀有可以选用ＣＴＡＢ提取法和ＣＴＡＢ改良法㊂通过比较这些方法的优劣势，可以为满足不同试验需要选择高效㊁简便㊁安全无毒㊁低成本的最优ＤＮＡ提取方法提供了一定理论依据，同时也为指导水稻不同组织部位ＤＮＡ的提取提供了参考价值，进一步为开发与优化快速提取药用野生稻基因组ＤＮＡ提供理论指导㊂参考文献［１］董岩，钱长根，张维林，等．药用野生稻体细胞杂交后代对条纹叶枯病的抗性鉴定［Ｊ］．生物技术通讯，２０１３，２４（５）：６８２－６８４．［２］杨雅云，张敦宇，陈玲，等．云南药用野生稻对四种水稻主要病害的抗性鉴定［Ｊ］．植物病理学报，２０１９，４９（１）：１０１－１１２．［３］杨士杰药用野生稻杂交后代对稻瘟病的抗性［Ｊ］．湖北农业科学，２０１７，５６（３）：４１５－４１７．［４］陈玲，张敦宇，陈越，等．云南药用野生稻种质资源的白叶枯病抗性评价［Ｊ］．南方农业学报，２０１９，５０（７）：１４１７－１４２５．［５］刘蕊，张欢欢，陈志雄，等．筛选和转化药用野生稻ＴＡＣ克隆获得耐旱水稻［Ｊ］．中国农业科学，２０１４，４７（８）：１４４５－１４５７．［６］苏龙，徐志健，乔卫华，等．广西药用野生稻遗传多样性分析及ＳＳＲ引物数量对遗传多样性结果的影响研究［Ｊ］．植物遗传资源学报，２０１７，１８（４）：６０３－６１０．［７］张霞，景翔，周光才，等．药用野生稻ＧＢＳＳ基因的系统发育及组织特异性表达［Ｊ］．植物学报，２０１９，５４（３）：３４３－３４９．［８］何平，疏冕，蔡晓丹，等．栽培稻ˑ药用野生稻种间杂种基因组ＤＮＡ甲基化的遗传与变异研究［Ｊ］．华北农学报，２０１７，３２（４）：１９－３１．［９］韩义胜，严小微，唐清杰，等．利用药用野生稻培育耐光氧化和耐荫水稻新种质的研究［Ｊ］．广东农业科学，２０１４，４１（８）：２２－２５．［１０］柯学，殷富有，肖素勤，等．云南药用野生稻的高光效特性［Ｊ］．中国稻米，２０１５，２１（４）：７２－７６．［１１］张大燕，李红梅，李培纲，等．药用野生稻ＯｏＬＥＡ１基因的克隆和生物信息学分析［Ｊ］．分子植物育种，２０１７，１５（５）：１５９７－１６０２．［１２］景翔．药用野生稻中淀粉合成酶基因家族的进化［Ｄ］．曲阜：曲阜师范大学，２０１６．［１３］郭辉，陈灿，张晓丽，等．广西野生稻耐冷性鉴定与遗传纯合研究［Ｊ］．西南农业学报，２０１７，３０（６）：１２４５－１２５０．［１４］李培纲，李红梅，张帅，等．药用野生稻ＡＤＦ基因的克隆及其抗逆性分析［Ｊ］．华北农学报，２０１７，３２（６）：３７－４４．［１５］王玲仙，王波，陈越，等．云南药用野生稻幼穗离体培养研究［Ｊ］．中国稻米，２０２０，２６（２）：４９－５３．［１６］ＯＨＴＳＵＢＯＫ，ＳＵＺＵＫＩＫ，ＨＡＲＡＧＵＣＨＩＫ，ｅｔａｌ．Ｎｏｖｅｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｅｐａ⁃ｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍｅｒｓｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｔｈｅｍａｔｅｒｉａｌｒｉｃｅｃｕｌｔｉｖａｒｓｏｆｒｉｃｅｗｉｎｅｂｙＰＣＲ［Ｊ］．ＪＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＭｅｔｈ⁃ｏｄｓ，２００８，７０（６）：１０２０－１０２８．［１７］李娥贤，殷富有，张敦宇，等．云南药用野生稻高质量染色体ＤＮＡ的制备［Ｊ］．作物杂志，２０２０（５）：１０３－１０９．［１８］ＡＢＤＥＬ⁃ＬＡＴＩＦＡ，ＯＳＭＡＮＧ．ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｒｅｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｅｘｔｒａｃ⁃ｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｔｏｏｂｔａｉｎｈｉｇｈＤＮＡｑｕａｌｉｔｙｆｒｏｍｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｅｔｈｏｄｓ，２０１７，１３：１－９．［１９］ＷＥＮＧＱ，ＬＩＪ，ＬＩＵＸＨ，ｅｔａｌ．ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌＤＮＡａｎｄｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＲＡＰＤｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎＤｉｏｓｃｏｒｅａｏｐｐｏｓｉｔａＴｈｕｎｂ．［Ｊ］．ＧｅｎｅｔＭｏｌＲｅｓ，２０１４，１３（１）：１３３９－１３４７．［２０］ＮＡＲＵＳＨＩＭＡＪ，ＫＩＭＡＴＡＳ，ＳＯＧＡＫ，ｅｔａｌ．ＲａｐｉｄＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅｐｒｅｐａｒａ⁃ｔｉｏｎｄｉｒｅｃｔｌｙｆｒｏｍａｒｉｃｅｓａｍｐｌｅｗｉｔｈｏｕｔｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｌｏｏｐ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏ⁃ｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）ｏｆｒｉｃｅｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏ⁃ｃｈｅｍ，２０２０，８４（４）：６７０－６７７．［２１］ＹＵＡＮＱＢ，ＨＵＡＮＧＹＭ，ＷＵＷＢ，ｅｔａｌ．Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｆｒｅｅ＆ａｄｓｏｒｂｅｄａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓｔｈｒｏｕｇｈａｗａｓｔｅｗａｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｌａｎｔｂｙａｎｅｎｈａｎｃｅｄｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＥｎｖｉｒｏｎＩｎｔ，２０１９，１３１［２０２２－０３－１４］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｅｎｖｉｎｔ．２０１９．１０４９８６．［２２］ＴＡＫＡＨＡＳＨＩＨ，ＴＡＫＡＫＵＲＡＣ，ＫＩＭＵＲＡＢ．Ａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍｔｙｐｅＡｉｎｒｉｃｅｓａｍｐｌｅｓ［Ｊ］．ＪＦｏｏｄＰｒｏｔ，２０１０，７３（４）：６８８－６９４．［２３］ＷＡＮＧＸＦ，ＣＨＥＮＹ，ＣＨＥＮＸＹ，ｅｔａｌ．ＡｈｉｇｈｌｙｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｒａｐｉｄＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄｌａｔｅｒａｌｆｌｏｗｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒｏｎ⁃ｓｉｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｃｒｏｐｓ［Ｊ］．ＡｎａｌＣｈｉｍＡｃｔａ，２０２０，１１０９：１５８－１６８．［２４］ＹＩＧ，ＣＨＯＩＪＨ，ＬＥＥＪＨ，ｅｔａｌ．Ｒａｐｉｄａｎｄｓｉｍｐｌｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｈｏｍｏｇｅ⁃ｎｉｚｉｎｇｌｅａｆｔｉｓｓｕｅｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｍｉｎｉ⁃ｍｉｄｉ⁃ｓｃａｌｅＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｉｎｒｉｃｅ［Ｊ］．ＰｒｅｐＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５，３５（３）：２５７－２６１．［２５］ＭＵＴＯＵＣ，ＴＡＮＡＫＡＫ，ＩＳＨＩＫＡＷＡＲ．ＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍｒｉｃｅｅｎｄｏ⁃ｓｐｅｒｍ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｆｒｏｍａｎｃｉｅｎｔｓｅｅｄｓａｍ⁃ｐｌｅｓ）［Ｊ］．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ，２０１４，１０９９：７－１５．［２６］ＢＯＪＡＮＧＫＰ，ＫＵＮＡＡ，ＰＵＳＨＰＡＶＡＬＬＩＳＮＣＶＬ，ｅｔａｌ．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｒａｃｅａｂｉｌｉｔｙｉｎｃｏｌｄｐｒｅｓｓｅｄ，ｓｏｌｖｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｒｅｆｉｎｅｄｇｒｏｕｎｄｎｕｔｏｉｌｓ［Ｊ］．ＪＦｏｏｄＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ，２０２１，５８（９）：３５６１－３５６７．［２７］ＤＵＡＮＹＢ，ＺＨＡＯＦＬ，ＣＨＥＮＨＤ，ｅｔａｌ．ＡｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｅｘ⁃ｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｐｒｅ⁃ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｉｎｒｉｃｅ［Ｊ］．ＧｅｎｅｔＭｏｌＲｅｓ，２０１５，１４（２）：６３６９－６３７５．［２８］ＳＡＧＩＮ，ＭＯＮＭＡＫ，ＩＢＥＡ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒ⁃ｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｒｉｃｅ（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ［Ｊ］．ＪＡｇｒｉｃＦｏｏｄＣｈｅｍ，２００９，５７（７）：２７４５－２７５３．９８５１卷１４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀毕继安等㊀药用野生稻基因组ＤＮＡ提取方法比较。

分类号密级UDC 编号学位论文亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂种不育的遗传研究Genetic studies on hybrid sterility between Oryza sativa L. and O.glaberrima Steud.任光云指导教师陶大云研究员云南省农业科学院昆明申请学位级别硕士学科专业名称作物遗传育种论文提交日期2006年6月论文答辩日期2006年6月学位授予单位云南农业大学年月日答辩委员会主席魏蓉城评阅人谭学林师常俊龚洵云南农业大学2006年6月云南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：呈交的学位论文“亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂种不育的遗传研究”是本人在导师的指导下进行研究所取得的成果。

除文中已引用的内容外，本论文不含任何其它个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。

对本论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中作了明确的说明，并表示了谢意。

本声明的法律后果由本人承担。

学位论文作者签名：日期： 2006年 6 月日目录摘要 (1)Abstract (2)1.引言 (3)1.1 非洲栽培稻，水稻改良中首选的基因库 (3)1.2 栽培稻种间杂种不育的遗传机理 (4)1.3 遗传标记 (5)1.4分子标记定位QTL的原理 (6)1.5 作图群体的组成及遗传连锁图谱的构建 (8)1.6 QTL定位、标记辅助选择 (9)1.7 数量性状研究今后的发展 (10)1.8 本研究的目的意义 (11)2.材料与方法 (13)2.1 遗传分析材料 (14)2.2 群体构建 (14)2.3 田间表型性状的调查 (15)2.4 基因型数据的收集 (16)2.5 近等基因系群体标记杂合率的检测 (17)2.6 用回交高世代群体对育性QTLs（基因）进行确认和定位 (17)3 结果与分析 (19)3.1回交过程中各个世代育性分离分析 (19)3.2 BC6F1近等基因系群体育性位点检测 (20)3.3用回交高世代群体（BC7F1）对育性QTLs的分析 (26)3.3.1回交高世代群体BC7F1.育性的表现 (26)3.3.2用回交高世代群体BC7F1对育性QTLs（基因）的分析 (29)3.3.3 BC7F1群体中定位的育性基因对育性作用力 (35)3.4回交高世代群体定位的新育性位点 (38)4 讨论 (41)4.1对已有位点的验证 (41)4.2新育性位点的发掘 (41)4.3 BC6F1与BC7F1结果偏差 (42)4.4 选择回交在QTLs定位中的作用 (42)4.5 实验技术讨论 (42)4.6 BC7F1群体的下一步验证 (43)5 结论 (44)参考文献 (45)致谢 (52)摘要在发掘利用亚洲栽培稻（Oryza sativa L.）近缘种有利基因的过程中，杂种不育及控制各种重要农艺性状有利QTLs位点的导入是当前研究的重点与难点。